基因工程FR?008/杀念菌素脱羧衍生物发酵过程优化

                作者：杨亮 毛相朝 周文瑜 陈实 沈亚领，邓子新 魏东芝 

【摘要】  以组合生物合成技术得到的基因工程FR?008/杀念菌素脱羧衍生物CS103为研究对象，在摇瓶水平进行培养条件的初步优化，确定了接种量、接种时间、发酵过程pH、装液量等初步条件。对3.7L发酵罐水平的培养条件进行优化，确定了最适搅拌转速和通气量，并初步建立了补料分批发酵工艺。结果表明，接种时间30h、接种量为10%、控制pH6.5～7.0、搅拌转速450r/min、通气量200L/h，发酵过程维持发酵液残余葡萄糖浓度5g/L左右，在3.7L发酵罐基因工程FR?008/杀念菌素脱羧衍生物CS103产量达到99.87μg/ml。本研究为基因工程FR?008/杀念菌素化生产工艺提供了依据。

【关键词】  链霉菌FR?008； 基因工程FR?008/杀念菌素； 衍生物； 发酵过程优化

    ABSTRACT  The novel derivatives of polyene macrolides antibiotic FR?008/candicidin with lower toxicity was conducted through combinatory biochemistry method. Firstly, several basic fermentation conditions were designed in shake flasks, such as inoculums age and size, broth volume and the pH of the fermentation process; secondly, the further optimization of the culture conditions was performed in a 3.7 L fermentor, and the optimization strategy allowed the antibiotic production increased to 99.87 μg/ml. This work made a stable theoretics for the fermentation scale?up process of the FR?008/candicidin derivatives with lower toxicity.

    KEY WORDS  Streptomyces sp.FR?008;  Genic FR?008/candicidin;  Derivatives;  Optimization

     通过组合生物合成技术，人们获得了大量的新的活性化合物［1］，组合生物合成已经成功地应用到聚酮类抗生素的结构改造［2，3］。研究证明杀念菌素和FR?008具有相同的化学结构，属于七烯大环内酯抗生素，有较强的抗真菌活性［4～7］，它们都能够通过与真核细胞膜中的固醇相互作用，形成跨膜通道，引起细胞内小分子和离子外漏而导致细胞死亡［8，9］。杀念菌素被广泛应用于念珠菌阴道炎，并且能够作用于胆固醇和胆汁代谢［10］。结构研究显示FR?008/杀念菌素在大环内酯母核上含有氨基海藻糖、芳香基侧链和羧基［4，11］，与两性霉素B的结构极其相似(图1［7，12］)。

    化学结构修饰显示，去除两性霉素B的环外羧基，能够大幅度降低毒性［13，14］，且抗菌活性增强。陈实等［7］获得了FR?008/杀念菌素的生物合成基因簇， 分R=COOH为FR?008/candicidin；  R=CH3为FR?008/candicidin脱羧衍生物CS103析发现fscP和fscFE基因分别负责P450单氧化酶FscP和铁氧化还原蛋白FscFE的合成，可能共同参与将C?18位的甲基侧链氧化为羧基基团。我们已经确证fscP基因缺失的突变株CS103其发酵产物为脱羧FR?008衍生聚酮抗生素，且毒性大大降低(未报道)。

    但是，基因工程FR?008/杀念菌素脱羧衍生物CS103发酵水平太低严重的限制了其进一步的研究开发，毛相朝等［15］优化了FR?008/杀念菌素及其系列基因工程衍生物的发酵生产培养基，产量大幅提高。Martin等［16，17］研究发现发酵过程中维持葡萄糖较低的浓度能够促进大环内酯抗生素candihexin的发酵水平。本文考察了摇瓶水平培养条件对基因工程杀念菌素脱羧衍生物CS103生物合成的影响，并成功放大到3.7L发酵罐水平，以其应用到抗生素CS103的规模化生产。

    1  实验材料和方法

    1.1  菌种

    缺失fscP基因的链霉菌FR?008突变株CS103由上海大学BIO?X生命中心邓子新院士惠赠，本实验室保藏。

    1.2  培养基

    (1)种子培养基(L)  葡萄糖10g，麦芽糖提取物3g，酵母粉3g，蛋白胨5g；以NaOH调pH7.2～7.5。

    (2)发酵培养基(L)  葡萄糖20g，淀粉10g，甘油13.89ml，酵母粉3g，工业氨基酸粉5g，蛋白胨1.01g，NaCl 10g，FeSO4·7H2O 0.5g，CuSO4 0.0428g；以NaOH调pH［15］。

    1.3  培养方法

    (1)种子培养  将300μl孢子悬液接种至含有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，接种后置28℃、200r/min摇床上培养30h左右。

    (2)摇瓶培养  按6%～12%的接种量将种子液转接到装100ml发酵培养基的500ml摇瓶中，接种后的摇瓶置28℃、200r/min摇床培养，调pH7.0左右。

    (3)发酵罐条件  种子培养基培养30h后按接种量10%接到3.7L罐；450r/min、200L/h通气量，28℃培养；用盐酸和氢氧化钠维持pH恒定在6.90。

    1.4  分析方法

    (1)细胞干重的测定  菌体浓度采用细胞干重法，40ml发酵液装入已称空重的离心管中，10000r/min离心10min，湿菌体置于50℃烘箱中烘干至恒重。

    (2)葡萄糖浓度的测定  葡萄糖测定方法采用美国金泉公司的YSI2700生化分析仪测定。

    (3)抗生素含量的测定  色谱柱为SB?C8(4.6mm×250mm)，流动相为20mmol/L、pH4.6乙酸铵缓冲液∶乙腈(60∶40，V/V)，流速1ml/min，柱温25℃，检测波长380nm［18］。

    2  结果和讨论

    2.1  基因工程FR?008/杀念菌素脱羧衍生物CS103摇瓶发酵条件优化

    分别按24、26、28、30、32、34、36、38和40h的不同接种时间，按4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的不同接种量，在250ml摇瓶中分别按10、25、50、75、100、150和200ml的装液量，发酵过程控制pH5.5、pH6.5、pH7.5、pH8.5，进行摇瓶培养，得到基因工程FR?008/杀念菌素脱羧衍生物CS103初步优化的发酵条件为：接种时间30h、接种量10%、250ml摇瓶中培养基装液量为25ml、发酵过程控制pH6.5～7.0。

    2.2  对3.7L反应器水平发酵条件的优化

    (1)搅拌转速对CS103发酵的影响  将摇瓶发酵条件放大至3.7L反应器水平，并对其搅拌转速进行了优化。在丝状菌发酵过程中，搅拌相对于溶氧对微生物的发酵过程有更明显的影响作用。抗生素CS103产生菌是链霉菌FR?008的突变株，属放线菌类，放线菌类菌丝细长，对过强的搅拌产生的应力很敏感，大量研究了剪切对菌丝形态和产物生成的影响［19～22］。因此研究搅拌转速对菌体生长和产物形成的影响是很有必要的。用KLF2000型3.7L发酵罐(Bioengineering AG，Switzerland)，装液量2L，在28℃，通气量为200L/h下进行分批发酵实验，分别用300、450、700和950r/min的搅拌转速，每12h取样测定残糖、生物量和CS103的发酵效价。

    图2是在搅拌速率为300、450、700和950r/min条件下的发酵进程曲线。研究发现，搅拌速度为450r/min时CS103发酵效价较高，发酵120h后CS103的发酵效价可达到88μg/ml左右。当转速太低时，如300r/min条件下，虽然发酵早期菌体生物量的增长较快，CS103的生产量也比较多，但随着菌体的增殖，出现供氧不足的情况，导致菌体增殖减缓，葡萄糖的利用率下降，所以最终CS103的发酵效价低于450r/min；转速太高时(如950r/min)早期葡萄糖消耗、菌体生长和CS103生成比较快，但中、后期糖耗、菌体生长和产物生成几乎停止，说明过高的搅拌转速产生的剪切力破坏了菌体的生理结构，导致CS103的生成曲线提前，发酵平衡期缩短，虽然发酵后期葡萄糖的利用率提高了，但CS103的发酵效价反而下降。

    (2)通气量对CS103发酵生产的影响  在前面结

    A、B、C、D：1：Cell Mass；  2：CS103；  3：Glucose；    E：1：450r/min；  2：700r/min；  3：300r/min；  4：950

    F：1：CS103，通气量200L/h；  3：DO，通气量200L/h；  5：Cell Mass，通气量200L/h；  6：CS103，通气量300L/h；

    7：DO，通气量300L/h；  8：Cell Mass，通气量300L/h

    图2    3.7L反应器水平发酵条件的优化果的基础上，在450r/min的条件下提高通气，由200L/h提高到300L/h，再提高发酵过程中的溶氧，看能否进一步提高产量。300和200L/h通气，450r/min相同搅拌条件下对比的发酵过程如图3F所示。从图中可以看出，提高通气后溶氧(DO)升高，DOmin提高到50%左右；菌体生长相比200L/h通气条件有较大提高，最高干重提高了44%；产量略有下降，约为22.2%。以上数据说明30%的DO肯定在其产物生成临界氧之上。在此条件下提高溶氧有可能对产物合成有一定的遏制作用，通过形成新生氧，超氧化物基O2-和过氧化物基O22-等，破坏许多细胞组分体现的［23］。同时也看出，提高溶氧能够促进菌体生长，但菌体过分生长可能会破坏与产物形成之间的平衡，因此控制生长不过量也是必要的。最终确定罐上发酵的条件是搅拌450r/min，通气量200L/h。

    2.3  补料分批发酵的研究

    (1)发酵过程维持糖浓度的确定  葡萄糖是一种快速利用的碳源，初始浓度过高，因分解代谢物阻遏作用而影响次级代谢物的合成，只有当葡萄糖消耗到一定量时，阻遏作用被解除，菌体才由生长阶段转入次级代谢产物合成阶段［24］。因此，本文研究了摇瓶中采取补料分批发酵，根据产生菌生长和抗生素合成的代谢，适当调节糖浓度，使代谢产物合成期有足够而不过多的碳源，延长抗生素分泌期，提高抗生素产量。

    首先在摇瓶水平采用间歇补料分批发酵，当发酵过程中糖浓度降到预定值的时候，开始补糖，维持此后糖浓度在此预定值左右，研究对CS103产量的影响。分别选取10、5和2.5g/L三个浓度作为发酵过程维持的糖浓度，对应初始葡萄糖浓度分别为20、10和10g/L，进一步确定发酵过程最佳残糖浓度。表1显示，葡萄糖浓度维持在5g/L对提高CS103产量的效果最好。当还原糖浓度维持在2.5g/L，由于表1    补糖时维持发酵液糖浓度的研究糖浓度太低，使菌体所需能量供应跟不上，也不能满足CS103合成的需要，在三批实验当中，菌浓最低，产量甚至低于分批发酵；当还原糖浓度维持在5g/L，这说明该浓度的葡萄糖流加，既可以防止菌体自溶及菌体产生抗生素能力的衰退，又不会产生分解代谢物阻遏作用，而且可以减少副产物有机酸的积累［24，25］。足够维持菌体生长和产物生成，并有效的延长抗生素分泌期，使CS103以最大的生产速率不断合成，最高产量相比分批发酵提高了约35%，而10g/L情况与5g/L相比，补入葡萄糖的利用效果不明显，产量相比分批发酵只有略为的提高。因此，发酵液中维持的还原糖浓度降选择为5g/L最好。

    (2)反应器水平补料分批发酵对产物合成的影响  根据摇瓶实验结果，发酵过程从36h左右开始补糖，共补糖四次，补入量为12g/L。0～36h之间主要是菌体生长期，大量的糖用于了菌体生长；36h后菌体生长变得缓慢，产物大量生成，这时开始补糖，能够让补入的糖大部分用于产物合成。与分批发酵相比，最高菌体量和产量都得到提高，分别为10%和13%，产量达到99.87μg/ml(图3)。

    3  结论

    通过摇瓶实验确定了基因工程FR?008/杀念菌素脱羧衍生物CS103初步优化的发酵条件为：接种时间30h、接种量10%、250ml摇瓶中培养基装液量为25ml、发酵过程控制pH6.5～7.0。3.7L反应器水平的发酵条件，确定搅拌转速为450r/min，通气量为200L/h。研究了补料分批发酵的影响，降低初糖浓度，当发酵液中糖浓度降到5g/L后，维持糖浓度在此值能够有效的提高CS103的发酵效价，在摇瓶水平使CS103产量由38.7μg/ml提高到52.3μg/ml，进一步在3.7L反应器放大，最终产量达到99.87μg/ml，取得了满意的结果。本研究为基因工程FR?008/杀念菌素脱羧衍生物CS103的化生产奠定了基础。

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