莽草酸对子囊霉素生物合成的影响

                      作者：穆云龙 余旭亚 孟庆雄 王洪钟

【摘要】  研究了添加莽草酸前体物质对子囊霉素生物合成的影响。结果表明，发酵培养24h时添加0.15%的莽草酸，至96h发酵结束时子囊霉素发酵效价最高，可达131.7mg/L；与不添加前体物质相比，子囊霉素发酵效价提高了51%。

【关键词】  子囊霉素； 生物合成； 莽草酸； 前体

子囊霉素(ascomycin)又叫FR?900520，FK?520，为23碳的大环内酯类化合物，是免疫抑制剂FK?506(他克莫司，tacrolimus)的乙基类似物，40多年前从含有吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的土壤中分离得到。以往只知道它具有抗真菌和抗生素活性，直到发现了类似物他克莫司才进一步推动了对子囊霉素性质和生物活性的认识。现在研究发现子囊霉素具有很强的免疫抑制剂作用，可用于自身免疫疾病和皮肤疾病，在预防器官移植排斥方面也很有效。虽然子囊霉素在免疫抑制剂方面的应用显示了良好的前景，但限制它使用的一个主要原因是产率低，成本过高，因此提高子囊霉素的发酵水平，以降低生产成本具有重要的意义。

    不同大环内酯类抗生素的生物合成大都是在起始单位上添加C2、C3、C4延伸单位，以及β?碳原子的变化。Wallace等［1］和 Wilson等［2］研究发现莽草酸在生物体内经脱水、加氢、重排等反应生成3，4?二羟基环己烷羧酸(dihydroxycyclohexanecarboxylic acid，DHCHC)，而后者正是子囊霉素生物合成的起始单位［3］。在聚酮合成酶的催化下，可以通过添加作为延伸单元的短链脂肪酸合成子囊霉素［4］。根据这一原理，本文选择莽草酸进行前体添加实验，期望通过前体的添加提高生物合成子囊霉素的产量。

    1  材料与方法

    1.1  菌种来源    Streptomyces hygroscopicus M?7?21，本实验室保存。

    1.2  培养基［5］

    斜面培养基(%)  葡萄糖1，牛肉膏0.4，蛋白胨0.4，酵母膏0.1，NaCl 0.25，琼脂2，pH7.0。

    种子培养基(%)  淀粉2.5，葡萄糖2，黄豆粉1.5，蛋白胨0.5，酵母粉0.5，硝酸钾0.25，NaCl 0.2，碳酸钙0.2，pH7.0。

    发酵培养基(%)  淀粉3.5，黄豆粉3，甘油1，豆蛋白胨1，磷酸二氢钾0.08，碳酸钙0.4，pH7.0。

    1.3  培养条件［6，7］

    斜面培养  28℃，培养10～15d。

    种子培养  28℃，新鲜斜面挖块接入种子瓶，装液40m1/250m1，摇床转速220r/min，培养40～60h。

    摇瓶发酵培养  28℃，10%种子液接种入发酵瓶中，装液100m1/500m1，摇床转速220r/min，培养96h。

    分离平板培养  与斜面培养条件相同，培养时间依菌落生长情况而定。

    1.4  检测方法

    按方法使用HPLC法测定发酵液中子囊霉素含量。

    HPLC条件  色谱柱： Diamonsil C18 column，250mm×4.6mm；流动相：甲醇∶水=70∶30；流速1.0ml/min。    检测条件  可见紫外分光光度计，205nm；进样量20μl。

    分析方法  将乙酸乙酯萃取的上清液浓缩过滤得样品滤液，用微量进样器准确吸取20μl样品滤液注入色谱仪，根据积分面积，对照标准曲线，发酵效价。

    2  结果与分析

    2.1  莽草酸对子囊霉素生物合成的影响

    大环内酯类抗生素的生物合成一般是在起始单位上添加乙酸盐或丙酸盐作为延伸单元，子囊霉素中的二羟基环己烷羧酸部分是其生物合成的起始单位，而二羟基环己烷羧酸是由莽草酸经脱水、加氢、电子重排等反应形成的。根据这一原理，本实验在发酵培养基中添加0.05%的莽草酸前体，以不加前体的普通发酵培养基为对照，发酵96h后测定发酵液中子囊霉素的含量。结果显示添加0.05%的莽草酸前体可提高子囊霉素产量，达到100mg/L，比不加前体提高15%。根据这一结果，在下面的实验中进行莽草酸加量及加入时间的优化实验。

    2.2  莽草酸浓度的选择

    确定莽草酸前体对子囊霉素的发酵有较显著的提高作用后，分别向发酵培养基中添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和0.5%的莽草酸，发酵96h后取样测定子囊霉素产量。

    结果当发酵培养基中莽草酸含量由0增加到0.15%时，子囊霉素产量持续上升；但当莽草酸浓度超过0.15%时，子囊霉素的产量明显降低。这可能是由于莽草酸浓度过高，引起培养基pH的变化，抑制菌丝生长，影响子囊霉素合成；也可能是由于高浓度的莽草酸对子囊霉素的合成有抑制作用，导致子囊霉素产量降低。因此，确定前体莽草酸的加量为0.15%，此时子囊霉素的产量为118.6mg/L，较对照组提高了36%。

    2.3  莽草酸添加时间的选择

    在摇瓶发酵培养的0、24、36、48和60h时向发酵培养基中加入0.15%的莽草酸前体，发酵96h后测定子囊霉素产量。

    结果24h加入莽草酸前体子囊霉素产量提高最大，其子囊霉素产量高达131.7mg/L，高于0h加入莽草酸的产量(118.6mg/L)，与不加前体时的产量(87.2mg/L)相比提高了51%。其原因可能因为0h加入的莽草酸部分合成芳香族氨基酸而被消耗掉，而24h加入的莽草酸大部分作为次级代谢的前体直接转化二羟基环己烷羧酸而参与子囊霉素的生物合成。而36h后添加莽草酸前体则产量明显降低，可能因为此时加入的莽草酸大部分还未来得及转化，发酵已经结束，莽草酸利用不充分。

    3  讨论

    Wallace等［1］和Wilson等［2］研究阐述了子囊霉素的生物合成途径。限制性前体是指影响次级代谢产物合成途经中关键中间体合成的前体化合物，添加适量的限制性前体可以促进中间体的合成，最终促进产物的合成［8］。大环内酯类抗生索的生物合成与饱和长链脂肪酸的生物合成相似，主要是通过聚酮途径在起始单位上延伸。子囊霉素的生物合成首先是合成莽草酸然后再通过脱水、加氢等反应形成二羟基环己烷羧酸，然后在其上通过聚酮途径添加乙酸、丙酸延伸［1，2，9］。因此在发酵培养基中加入适量的前体莽草酸，通过代谢调控，就有可能缩短其生物合成周期，提高子囊霉素产量。本实验研究表明，利用吸水链霉菌生产子囊霉素，发酵培养24h时在发酵培养基中添加0.15%的莽草酸，至96h发酵结束时子囊霉素产量最高，可达到131.7mg/L，与不添加前体物质的发酵培养相比，子囊霉素产量提高了51%。在本研究中，莽草酸的加入能明显地促进子囊霉素的生物合成，这与莽草酸作为含氮大环内酯类抗生素合成的起始单位作用一致［3］。

【】
  ［1］ Wallace K K, Reynolds K A. Biosynthetic studies of ascomycin (FK520): Formation of the (1R,3R,4R)?3,4?dihydroxycyclohexanecarboxylic acid?derived moiety ［J］. J Am Chem Soc,1994,116(25):11600～11601.

［2］ Wilson D J, Patton S, Florova G, et al. The shikimic acid pathway and polyketide biosynthesis ［J］. J Ind Microbiol Biotechnol,1998,20(5):299～303.

［3］ 孙丽娟，黄捷. 含氮大环内酯类免疫抑制剂的生物合成［J］. 海峡药学，2007，19(6)：11～15.

［4］ Wu K, Chung L L, Revill W P, et al. The FK520 gene cluster of Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC 14891) contains genes for biosynthesis of unusual polyketide extender units ［J］. Gene,2000,251:81～90.

［5］ Morisaki M, Arai T. Identity of immunosuppressant FR?900520 with ascomycin ［J］. J Antibiot,1992,45(1):126～128.

［6］ Kumar P, Shorma S K, Malriya H K, et al. An improved fermentation prosess for preparing ascomycin. WO,2007029082 ［P］. 2007?03?15.

［7］ Masakuni O, Tanak H, et al. Method for inhibiting lymphokine production. US,6201005B1 ［P］.2001?03?13

［8］ 张育杰，胡海峰，朱宝泉. 前体对洛伐他汀生物合成的影响［J］. 抗生素杂志，2006，31(9):529～531.