统计学法优化必特螺旋霉素发酵培基养
作者：吴春海 郝玉有 王永红 储炬 庄英萍 张嗣良
【摘要】 利用Plackett?Burman设计法析出影响必特螺旋霉素效价的四个最显著的因素，以Box?Behnken设计法及响应面分析法确定了主要因素的最佳浓度，即鱼粉22.8g/L，酵母粉2.44g/L，CoCl2 9.25mg/L，NaCl 9.13g/L，此时必特螺旋霉素效价为2245μg/ml。新配方验证结果表明必特螺旋霉素效价和必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素的含量在96h分别达到2380μg/ml和54%，比原配方分别提高了53%和20%。
【关键词】 必特螺旋霉素； Plackett?Burman设计； 响应面法； 发酵培养基
ABSTRACT Four nutritional factors that influenced the titre of carrimycin most significantly were screened out using Plackett?Burman experimental design, and then optimized by Box?Behnken factorial design of response surface methodology in shake flask cultures. Maximum carrimycin titer of 2245 μg/ml was predicted in the medium containing fish meal 22.8 g/L, yeast powder 2.44 g/L, CoCl2 9.25 mg/L, NaCl 9.13 g/L using response surface plots and point prediction tool of DESIGN EXPERT7.0 software. Compared to the culture with original medium, the titer and relative content of total isovalerylspiramycins with the optimized medium were increased by 53% and 20% in 96h respectively.
KEY WORDS Biotechspiramycin; Plackett?Burman design; Response surface metholodology; Fermentation medium
大环内酯类抗生素4"位酰基化后，由于酰化物亲脂性提高，其体内外抗生素活性尤其是体内抗菌活性与效果显著提高，并且碳霉糖4"羟基酯的碳链越长在体内的抗菌活性和稳定性越好，表现为：异戊酰基化>丙酰基化>乙酰基化［1，2］。采用基因工程技术可在大环内酯类抗生素碳霉糖4"位连接上酰基碳链。必特螺旋霉素［biotechspiramycin，曾用名生技霉素，建议用名可利霉素(carrimycin)］是将克隆自碳霉素产生菌的4"?O?异戊酰基转移酶基因整合到螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticus F?21的染色体上而构建成的一株稳定的基因工程菌WSJ?1?195所产生的一组以4"?O?异戊酰螺旋霉素为主成份的多组分新型抗生素，是一种新型大环内酯类抗生素［3，4］。
培养基优化是一个非常繁琐的工作，通常先筛选出重要的因子，然后通过各种方法对其进一步优化［5］。Plackett?Burman设计法是一种有效的两水平实验设计方法，虽然此设计方法不能考察各因子之间的交互作用，但它可以利用最少的实验次数，从众多的考察因素中快速而有效地筛选出主要的影响因子［6］。响应面法(response surface methodology，RSM)是一种优化过程的综合技术，采用该法可以建立连续变量曲面模型，对影响生物过程的因子水平及其交互作用进行优化与评价。与传统优化方法相比，RSM所需的试验组数相对较少［7，8］，因此基于这种统计方法的实验设计广泛地应用于化学、生物等方面，都取得了相当不错的效果［9，10］。本研究试图基于上述统计学方法通过优化培养基配方来达到提高必特螺旋霉素生物效价(效价)和改善必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素含量(组分)的目的。
1 材料与方法
1.1 菌种、培养基和培养条件
(1)菌种 实验所用的菌种为必特螺旋霉素基因工程菌WSJ?1?195，由沈阳同联集团上海生物技术研究所提供。
(2)培养基 斜面培养基、种子培养基、发酵培养基、生物效价测定培养基均按配制［11］。
(3)基本发酵工艺流程 将1ml甘油管接种于一级摇瓶，28℃培养48～56h后，按10%接种量接种于二级种子摇瓶中，28℃培养24～26h。按8%接种量接种于发酵摇瓶(50ml/500ml)中，220r/min，28℃旋转式摇床培养96h。取样测定各种发酵代谢参数，测定结果为3个样的平均值。
1.2 测定方法
(1)生物效价测定［11］ 按药典采用杯碟法测定生物效价，乙酰螺旋霉素为标准品，枯草芽孢杆菌为鉴定菌。
(2)必特螺旋霉素组分测定 色谱仪：Agilent1100(检测器：G1314A紫外检测器；进样器：G1328A色谱柱：Shim?pack VP?ODS，5μm，150mm×4.6mm；流动相组成为1% NaH2PO4∶甲醇(53∶47)，流速1ml/min，进样量20μl，检测波长231nm，柱温25℃。
1.3 实验设计
(1)Plackett?Burman实验设计 实验设计及数据处理均利用Design Expert 7.0 Software (Statease，USA)。根据必特螺旋霉素产生菌生长和生物合成的一般，以及前期实验结果，本实验共选取影响因素(变量)l6个。因此，选用了N=20的PB设计表，表中预留3个空项(Dummy)作误差分析，其中处理20为原始培养基的配方。各参数所代表因素及其水平见Tab.1和Tab.2，评价指标(响应值)为必特螺旋霉素效价(Y1)和必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉 素含量(Y2)。
(2)最陡爬坡实验 找出主要因素之后，通过使主要因素同时朝响应值增大的方向变化，找出峰值，逼近最大响应区间。
(3)响应曲面(RSM)实验设计 采用Box?Behnken法，对Plackett?Burman实验设计筛选出的关键因子和最陡爬坡实验确定的浓度进行进一步研究，以获得最佳培养基。
2 结果与讨论
2.1 Plackett?Burman设计
首先筛选出培养基中影响必特螺旋霉素效价和组份的关键因子，并以效价为响应值可得一次拟合回归方程：
Y1=+1168.60+99.60B-121.80E-115.40G-134.20L+176.90M+78.90P-136.70R-75.80T(1)
分析结果显示，B(肌醇)、E(酵母粉)、G(鱼粉)、L(硫酸铜)、M(磷酸二氢钾)、P(氯化钴)、R(钼酸钠)和T(氯化钠)对效价影响显著，其中B、M、P是正效应，E、G、L、R、T是负效应。
以组份为响应值可得另一个一次拟合回归方程：
Y2=+46.30+2.23A+2.73D-2.16G+1.76H-2.31L-2.42M-3.13T(2)
分析结果显示，A(淀粉)、L(硫酸铜)、M(磷酸二氢钾)和T(氯化钠)对组成份影响显著，其中A是正效应，L、M、T是负效应，D、H为空项。
本研究的主要目的是使效价提高的同时组份也提高或不降低。以效价和组份都较高的批次13(Tab.1中)的培养基组成为原点进行进一步优化。由于对M(磷酸二氢钾)来说效价和组份正好是一对成反比的指标，如想提高效价和组份中的一项另一项指标必然下降，故只能固定其浓度，E(酵母粉)和G(鱼粉)对于效价是负效应对组分影响不大，P(氯化钴)对效价是正效应对组份影响不大，T(氯化钠)对效价和组分都是负效应，虽然B(肌醇)对于效价是正效应但由于价格比较贵，如浓度太高发酵培养基成本也将大幅度提高，故将肌醇固定在较低浓度。所以以效价为响应值对E(酵母粉)、G(鱼粉)、P(氯化钴)、T(氯化钠)进行进一步优化，其余因素均以批次13(Tab.1中)为准。
2.2 最陡爬坡实验
针对酵母粉(X1)、鱼粉(X2)、氯化钴(X3)、氯化钠(X4)的质量浓度进行最陡爬坡实验，结果如Tab.3所示。
2.3 培养基的优化
上述最陡爬坡实验结果提示，响应变量Y(效价)值接近最大响应值区域。以处理3(Tab.3)的培养基组成为原点进行响应面分析实验设计，根据Box?Bohnken的设计原理，4因素各取3水平，设计了4因素3水平包括5个中心点共29个试验点的响应面分析实验，以测得的效价为响应值(Tab.4和Tab.5)。
运用DESIGN EXPERT 7.0软件对实验数据进行多项式回归，得到二次经验模型：
Y=2205.2-49.91A-54.91B+46.00C
+234.17D-16.50AB+218.50AC
-178.75AD+233.00BC+179.75BD
+61.50CD-108.23A2-255.22B2
-350.10C2-568.35D2(3) Tab.4 Experimental design and results of the Box?Behnken
StdYeast
powderFish
mealCoCl2
NaCl
Titer (μg/ml)ActualPredictedStdYeast
powderFish
mealCoCl2
NaCl
Titer (μg/ml)ActualPredicted1-1-1 0 02000193016 0 1 1 0197718242 1-1 0 01886186317-1 0-1 0203519693-1 1 0 01800185318 1 0-1 0152314334 1 1 0 01620172119-1 0 1 0150016245 0 0-1-11080106820 1 0 1 0186219626 0 0 1-11020103721 0-1 0-1128913827 0 0-1 11400141322 0 1 0-19209138 0 0 1 11586162823 0-1 0 1145014919-1 0 0-11200116624 0 1 0 11800174010 1 0 0-11480142325 0 0 0 02285220511-1 0 0 11996199026 0 0 0 02178220512 1 0 0 11564153427 0 0 0 02160220513 0-1-1 01753184228 0 0 0 02188220514 0 1-1 01200126629 0 0 0 02215220515 0-1 1 015981468
Tab.5 Level of nutrient factors used in Box?Behnken
experiment design
Nutrient parameter Levels-101Yeast powder (g/L)246Fish meal (g/L)172329CoCl2 (mg/L)21018NaCl (g/L)4812
由ANOVA分析结果，方程有一个较高的确定系数(R2=0.9664)，说明96.64%的试验数据可以用这个方程解释。Fig.1列出了部分出的模型的响应面图。所有的响应面图/等高线都能用来分析得出各因子的最优化值，但是很难同时分析。利用Design expert软件的point prediction功能可以用来预测必特螺旋霉素效价最高时的各因子的最佳值。当各因子的优化值为酵母粉2.9g/L，鱼粉22.8g/L，CoCl2 9.26mg/L，NaCl 9.13g/L时，必特螺旋霉素效价可达到最大2251μg/ml。二次经验模型显示了因子间的交互作用。从等式(3)中我们可以看到酵母粉与CoCl2有正交互作用，酵母粉与氯化钠对效价有负交互作用。保持其它因子不变时培养基成分对效价的相对影响可以用等高线(二维)和响应曲面图(三维)来表示［5］。Fig.1表明随着鱼粉，CoCl2浓度的增加效价先增加后下降，低浓度的酵母粉可使效价达到最高。
为了验证预测值，以预测确定的各因子值做重复实验，三次实验必特螺旋霉素平均效价为2380μg/ml，表明模型的有效性为93%，比对照(即原配方)提高了53%。同时必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素的含量达到54%，比对照(即原配方)提高了20%。基本达到了实验初设想的必特螺旋霉素效价和必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素的含量同时提高的目的。
3 讨论
由于必特螺旋霉素是一组以4"?O?异戊酰螺旋霉
Fig.1 Response surface plot showing interaction effect of two nutrient factors素为主成份的多组分新型抗生素，所以培养基的优化相当重要，且必须考虑到效价和组分两个指标。本实验室之前利用中心组合设计优化必特螺旋霉素合成培养基［12，13］，但由于当时的条件限制在析因实验时没有考虑到各因子对组分的影响，以至虽然效价有大幅度提高但同时组分也下降很大，缺乏实际应用价值。本实验将统计学分析方法应用到必特螺旋霉素发酵培养基的优化上，得到了预期的结果。本实验首先通过Plackett?Burman设计法分别对培养基中影响必特螺旋霉素效价和必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素的含量进行评价，分别筛选出显著影响效价和组分的因子，以效价和组份都较高Plackett?Burman设计表中批次13(Tab.2)的培养基组成为原点，再通过Box?Behnken设计及响应面分析，拟合出一个二元二次多项式方程，找出了最佳值，并通过验证实验证明达到了预期的效果。在验证实验中发现，发酵过程中新的配方比原来的配方糖耗明显加快，在78h葡萄糖就已基本检测不到，这使菌体在发酵中后期的产素阶段都处于低糖环境，必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素的含量提高明显。已有报道［14，15］，葡萄糖抑制支链α酮酸脱氢酶的活性，葡萄糖浓度为1mmol/L时支链α酮酸脱氢酶(BCKDH)的E1α亚基的mRNA水平是葡萄糖浓度为20mmol/L时的20倍，在糖饥饿的情况下，支链α酮酸脱氢酶(BCKDH)的活性会大幅度提高。亮氨酸的中间代谢物异戊酰CoA是异戊酰螺旋霉素的异戊酰基侧链主要供体，所以推测优化培养基后必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素的含量提高的原因可能是发酵后期低葡萄糖浓度解除了葡萄糖对支链α酮酸脱氢酶的抑制。具体机理将作进一步深入研究。
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