鲍曼不动杆菌老年患者分离株中发现16S rRNA甲基化酶基因新亚型
【摘要】 目的 了解鲍曼不动杆菌老年患者分离株16S rRNA甲基化酶和氨基糖苷类修饰酶基因型。方法 采用PCR检测20株鲍曼不动杆菌老年患者分离株12种16S rRNA甲基化酶和氨基糖苷类修饰酶基因。结果 7株检出16S rRNA甲基化酶基因(armA)，19株检出氨基糖苷类修饰酶基因［其中aac(3)?I阳性率为95%，ant(3")?I为95%，aac(3)?II为40%，aac(6′)?Ib为15%)］。6号株armA基因测得序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库(GenBank)已登录的armA氨基酸不同，为新亚型。结论 本组鲍曼不动杆菌老年患者分离株95%携带16S rRNA甲基化酶和氨基糖苷类修饰酶基因。
【关键词】 鲍曼不动杆菌； 16S rRNA甲基化酶； 氨基糖苷类修饰酶
ABSTRACT Objective To investigate the genotype of 16S rRNA methylase and aminoglycoside?modifying enzymes in Acinetobacter baumannii isolates in the elderly patients. Methods The genes of 12 kinds 16S rRNA methylase and aminoglycoside?modifying enzymes were detected by polymerase chain reaction (PCR). Results In 20 strains, 7 strains carried 16S rRNA methylase gene (armA); 19 strains were positive for the genes of aminoglycoside?modifying enzymes ［the positive rates of aac(3)?I, ant(3")?I, aac(3)?II and aac(6′)?Ib were 95%, 95%, 40% and 15% respectively］. Serial change appeared of amino acids in the sequence of armA of No.6, which identified itself as new subtype. Conclusion 95% of the Acinetobacter baumannii isolates in the elderly patients were carrying 16S rRNA methylase and aminoglycoside?modifying enzymes.
KEY WORDS Acinetobacter baumannii; 16S rRNA methylase; Aminoglycoside?modifying enzymes
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，AB)广泛分布于界，是感染病原菌最常见菌种之一。AB对β?内酰胺类和氨基糖苷类在内的常用抗菌药物出现多重耐药性。有关氨基糖苷类药物的耐药机制，国内已较多报道了6～9种氨基糖苷类修饰酶基因存在情况［1～5］。近年来，国外学者从其它非发酵菌中发现了氨基糖苷类耐药新机制——16S rRNA甲基化酶(rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、armA)［6～10］。为了解老年患者医院感染的分离株氨基糖苷类药物各种耐药相关基因存在状况，我们检测了armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、aac(3)?I、aac(3)?II、aac(6′)?Iad、aac(6′)?Ib、aac(6′)?II、ant(3")?I、ant(2")?I、16S rRNA甲基化酶与氨基糖苷类修饰酶基因，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
20株AB均分离自2005年9月～2006年12月老年住院患者痰标本。老年住院患者年龄61～89岁，男、女各10例。 全部菌株均使用VITEK?2细菌鉴定仪鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。
1.2 抗菌药物敏感性试验
采用微量肉汤稀释法测定13种抗菌药物的敏感性，根据美国CLSI 2005年版要求进行敏感性判断，13种抗菌药物的敏感性见表1。
1.3 细菌处理
挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl)，56℃水浴2h，改95℃水浴10min，加入Chelex?100 40μl，离心(15000r/min)30s。上清液即为基因检测的模板液，-20℃冰箱保存备用。
1.4 基因检测
基因检测采用PCR法，各种靶基因引物序列和目的产物长度见表2。各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P1、P2引物各0.5μmol/L，dNTPs各200mmol/L，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，Tris?HCl(pH9.0)10mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%(W/V)，Taq DNA pol 1U。总反应表1 20株AB菌13种抗菌药物的敏感性
体积20μl(其中模板液5μl)。热循环参数(PCR产物长度>500bp)为：93℃预变性2min，然后93℃ 60s→55℃ 60s→72℃ 60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min，其余均为：93℃预变性2min，然后93℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。
1.5 阳性基因测序
采用PCR直接全自动荧光法，在美国ABI公司3730型仪上进行。
2 结果
2.1 16S rRNA甲基化酶基因
20株AB菌老年患者分离株中16S rRNA甲基化酶基因armA阳性7株(35%)，其余基因均阴性。6号株作阳性基因测序。测得序列经比对与美国核酸库(GenBank)已登录的armA序列均不同，将测得序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库已登录的armA氨基酸序列比较，有2个氨基酸差别(图1)。因此可以确认为新亚型，本文已以armA?like登录于美国GenBank(登录号EU254717)。
2.2 氨基糖苷类修饰酶基因
20株AB中氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)?I阳性19株(95%)，ant(3")?I阳性19株(95%)，aac(3)?II阳性8株(40%)，aac(6′)?Ib阳性3株(15%)；共有19株(95%)检出氨基糖苷类修饰酶基因。5种16S rRNA甲基化酶、7种氨基糖苷类修饰酶基因检出结果见表3。表2 靶基因PCR引物序列Sbjct=armA氨基酸序列； Query=本文测得DNA序列翻译成氨基酸序列。 Score=472 bits(1215)； Expect=8e?132；
Identities=232/234(99%)； Positives=234/234(100%)； Gaps=0/234(0%)； Frame=+1)。
以上数据由www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTx软件获取
图1 测得armA DNA序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库已登录的armA氨基酸序列比较表3 16S rRNA甲基化酶、氨基糖苷类修饰酶基因检出结果本表未列出的16S rRNA甲基化酶、氨基糖苷类修饰酶基因检测结果均为阴性。
3 讨论
鲍曼不动杆菌是感染特别是ICU患者通气相关的最常见菌种之一。当鲍曼不动杆菌是主要病原菌时，通气相关肺炎的病死率高［11］。老年患者往往因慢性病而住院，由于住院时间长，抵抗力差和长期卧床等因素易于发生医院内感染。而耐药菌感染可导致患者住院时间延长，费用增加，病死率增高。
细菌对氨基糖基类药物耐药是通过产氨基糖苷类修饰酶、细菌16S rRNA基因甲基化酶和氨基糖苷类药物作用靶位16S rRNA基因(16S rDNA)突变而致［12，13］，其中氨基糖苷类修饰酶国内已有较多关注。
本研究7株检出16S rRNA甲基化酶基因(35.0%)，19株检出氨基糖苷类修饰酶基因(95.0%)。只有1株未检出16S rRNA甲基化酶基因与氨基糖苷类修饰酶基因，是否为16S rRNA基因(16S rDNA)突变而致有待进一步分析。
药物学家曾通过改造老的氨基糖苷类药物的结构改善对产氨基糖苷类修饰酶细菌的抗菌效能［14］，如通过脱氧反应，3′?脱氧卡那霉素(托普霉素)能拮抗3′位修饰酶的修饰，即该药对仅产3′位修饰酶的细菌有效；3′，4′?双脱氧卡那霉素(地贝卡星)能拮抗3′和/或4′位修饰酶的修饰，即该药对产3′和/或4′位修饰酶的细菌仍有效。通过烷酰基化，丁胺双脱氧卡那霉素(阿贝卡星)(地贝卡星在C1位NH2上接L?AHB)能拮抗3′、4′、6′、2"位修饰酶的修饰，阿贝卡星能拮抗大多数的修饰酶。
检索美国NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)已登录的16S rRNA甲基化酶基因与氨基糖苷类修饰酶基因一样，绝大多数位于整合子、质粒等可移性遗传元件上，易于在细菌间传播。16S rRNA甲基化酶能使药物作用靶位甲基化，导致甲基化后与氨基糖苷类药物亲和力下降而高耐氨基(下转第441页)(上接第 页)糖苷类药物。16S rRNA甲基化酶在细菌间快速传播将堵住通过改造老的氨基糖苷类药物的结构提高抗菌作用开发新药的路子。16S rRNA甲基化酶所致的氨基糖苷类药物耐药应引起国内同行的足够关注。
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