头孢曲松壳聚糖?海藻酸钠(钙)微球制备及性能研究

                   作者：李柱来 王津 陈莉敏 张婉春 赵传春

【摘要】  以壳聚糖?海藻酸钠为基质材料，在乳化体系中以复凝聚法制备头孢曲松壳聚糖?海藻酸钠(钙)微球，研究了成球的最佳工艺条件及载药微球性能。结果显示，最佳工艺制备条件为壳聚糖浓度∶海藻酸钠浓度=1∶1，pH4.0，反应温度25℃，搅拌速度200r/min。体外实验表明形态圆整的载药微球具有良好溶胀和缓释性能。

【关键词】  头孢曲松； 壳聚糖； 微球； 缓释

    ABSTRACT  The process and characterization of ceftriaxone microspheres made by complex coacervation method in an emulsion system with alginate?chitosan as matrix material were imyestigated. Results showed that optimal conditions were conantration of (chitosan∶alginate)=1∶1, pH=4.0, rotation rate=200r/min, T=25℃, and that the excellent sustained release and swelling behaviour were achived by the microspheres.

    KEY WORDS  Ceftriaxone;  Chitosan;  Microspheres;  Sustained release

     头孢曲松为第三代头孢菌素类广谱抗生素，有较强的抗菌活性［1，2］，广泛用于各类细菌的感染，但稳定性较差［3］，只能临用前配制，并于低温条件下保存。使用过程中发现该药存在许多不良反应［4～6］，且呈剂量相关性。为克服上述缺陷，提高头孢曲松的稳定性，我们通过微型成球技术［7］，将头孢曲松制成微球，增加化学稳定性，并使其在体内特定靶点缓慢缓放，提高生物利用度，克服局部药物浓度过大而产生的肾衰等副作用。壳聚糖［8，9］、海藻酸钠［10，11］均属天然海洋生物多糖，分别荷带正负电荷，可互相凝聚形成载药微球［12，13］。本文拟以壳聚糖和海藻酸钠为基质材料，在乳液体系中用复凝聚法将头孢曲松包裹成可生物相容，降解无毒的载药微球，研究了微球制备工艺及其性能。

    1  实验部分

    1.1  材料与方法

    壳聚糖(大连鑫蝶甲壳素公司， 粘度35CPS， 脱乙酰度92.8%)；海藻酸钠(CP，医药集团上海化学试剂公司)；头孢曲松钠(荷泽睿辰科技开发有限公司，原料药)；戊二醛(AR，天津博迪化工有限公司)；冰乙酸(AR，上海化学试剂有限公司)；氢氧化钠、无水氯化钙(AR，浙江兰溪城南化工厂)；液体石蜡、司班80(CP，国药集团化学试剂有限公司)；硫酸铁铵(上海化学试剂总厂所属上海试剂四厂)。

    天平BS110S(上海恒平仪器有限公司)；XSZ?2G生物显微镜(重庆光学仪器厂)；PHS?3B精密PH计(上海精密科学仪器有限公司)；752型紫外分光光度计(上海精密科学仪器厂)；超声细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司)；电动搅拌器(国华电器有限公司)；恒温水浴锅(国华电器有限公司)；抽滤装置(SHB?B95A型循环水式多用真空泵、布氏漏斗)。

    1.2  实验方法

    1.2.1  复凝聚法制备工艺

    (1)壳聚糖?海藻酸钠(钙)空白微球的制备  在250ml三颈烧瓶中加0.25g海藻酸钠(钙)固体，用15ml蒸馏水溶解并分散均匀，加入15ml液体石蜡，再加0.15ml约3滴的司班80，室温下以200r/min搅拌30min，静置形成W/O型乳液。将0.25g壳聚糖以20ml 2% HAc溶解，再加入1.0g CaCl2置于分液漏斗内，搅拌下逐滴加入到上述W/O型乳液中，控制滴速16ml/h(约1d/10s)。滴完后，继续搅拌30min，加入0.5ml戊二醛固化30min后，加入25ml正丁醇，充分振摇后放置30min，分出沉淀物，即为壳聚糖?海藻酸钠(钙)微球，以蒸馏水洗涤数次后，于35℃真空干燥5h，后置于干燥器中保存。

    (2)头孢曲松壳聚糖?海藻酸钠(钙)载药微球的制备  方法参照空白微球的制备方法，不同的是在分液漏斗中除了以20ml 2% HAc溶解的0.25g壳聚糖、1.0g CaCl2外，再加入0.1g头孢曲松钠。

    1.2.2  微球制备工艺条件选择?正交实验设计  根据前期的探索性实验，确定以微球基质材料壳聚糖海藻酸钠重量浓度比，成球pH，搅拌速度，成球温度为影响因素，每个因素选取3个水平，以微球的包封率为优化指标，用正交表L9(34)安排实验，结果见表1。表1        正交实验设计表

    1.2.3  包封率测定

    (2)绘制工作曲线［14］  称适量头孢曲松钠加水配成1.00g/L头孢曲松钠标准溶液，同时配0.415mol/L硫酸铁铵溶液(将20g硫酸铁铵，加入质量分数98%的浓硫酸9.4ml，加水至100ml定容)。分别准确吸取头孢曲松钠标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0ml于8只10ml比色管中，加入0.415mol/L硫酸铁铵溶液0.5ml，用去离子水稀释至刻度摇匀，用1cm的比色皿，以试剂空白为参比，在波长470nm处测其络合物的吸光度A，对其进行线性回归得方程：

    A=1.6234C+0.0097  r=0.9998，n=8

    (2)包封率测定  精密称取正交实验项下的含头孢曲松的微球0.5g，加入25ml蒸馏水，超声粉碎30min(超声6s，间隙7s，功率700W)，放至室温后抽滤，取滤液5ml，照工作曲线制备项下的方法，在470nm处测定吸光度A，根据回归方程浓度C(g/ml)，计算包封率：

    包封率=微球中头孢曲松的量投药量×100%

    载药量=微球中头孢曲松的量微囊总重量×100%

    (3)回收率实验  分别精密称取适量头孢曲松钠配成标准液，加入一系列含药量已知的头孢曲松微球样品中，按上述药物包封率的测定方法，以下式计算回收率：

    回收率=(W总-W微球)W加入×100%

    测得平均回收率为(99.2±0.9)%，表明微球的囊材不干扰头孢曲松钠的测定。

    1.2.4  头孢曲松壳聚糖?海藻酸钠(钙)微球吸水膨胀实验［15］  精确称取一定质量干燥的微球，置于一的确良制的小白布袋中，向袋中添加蒸馏水后将其悬空吊着，待一定时间后，用滤纸吸干微球表面吸附的蒸馏水称重(湿重)，一直到微球的湿重为恒定值。溶胀度的计算公式为：

    St=(Wt-W0)W0×100%

    Wt为t时间微球吸水溶胀衡时重量，W0为干燥微球的重量。

    1.2.5  头孢曲松壳聚糖?海藻酸钠(钙)微球体外溶出实验  以磷酸盐缓冲液(pH6.8)900ml为溶出介质，转速100r/min，温度(37±0.5)℃。将适量微囊M(g)装进透析袋中，然后放入转篮中，在不同时间段取5ml，用微孔滤膜过滤，并补入等量介质，取滤液在470nm处测定其光密度D，由标准曲线回归方程查出浓度为C，并计算溶液中头孢曲松的含量及累积溶出百分率：

    累积溶出百分率=溶液中头孢曲松的含量(M×载药量)×100%

    2  实验结果与讨论

    2.1  最佳工艺选择

    通过前期对复凝法制备微球的分析，确定对微球粒径大小、包封率及载药量有影响的4个因素：壳聚糖∶海藻酸钠的浓度、搅拌速度、成球反应时的介质pH值和反应温度，每个因素3个水平，按L9(34)正交设计安排实验得到结果如表2，表中质量指标是以2000版《中国药典》控制微球质量的指标(微球的包封率和载药量)。

    由极差值R分析，本成球工艺中四因素对微球的质量影响依次为：成球pH值，成球反应时的温度，壳聚糖浓度和搅拌速度。由于本工艺原理采用复凝聚法，    表2    正交实验结果系由成球基质材料荷相反电荷的基团之间，通过静电作用相互凝聚沉淀生成微球，溶液的pH值直接决定两材料的荷电状态，因此，pH成为成球工艺的关键因素［16］。成球反应温度、壳聚糖浓度与海藻酸钠浓度比对形成微球的包封率、载药量影响大，搅拌速度影响了微球的粒径分布。通过计算与分析得出最佳工艺条件是A2B2C3D2，即壳聚糖浓度∶海藻酸钠浓度为1∶1，pH4.0，反应温度25℃，搅拌速度200r/min。由于最佳制备条件在成球实验号中未出现，因此根据最佳制备工艺条件制备一批微球，测其包封率为71.25%，载药量为13.51%，实验结果理想，且该微球制备工艺稳定，重现性良好。

    2.2  头孢曲松壳聚糖?海藻酸钠(钙)微球形态分析

    (1)头孢曲松壳聚糖?海藻酸钠(钙)微球粒径分布  用校正过的带目镜测微尺的显微镜测微球的粒径大、小与分布，计数3批，每批200个，发现搅拌速度较小条件下制得的微球粒径相对较大，搅拌速度较大条件下制得的微球粒径相对较小。其中根据最佳工艺制备得到的微球粒径大于95.0μm占3.2%，粒径在85.0～95.0μm占26.3%，粒径在75.0～85.0μm占43.1%，粒径在65.0～75.0μm占25.1%，粒径小于65.0μm占2.3%，符合高斯分布，平均粒径为80.31μm。

    (2)头孢曲松壳聚糖?海藻酸钠(钙)微球电镜分析  观察最佳制备工艺下制得的微球扫描电镜图发现空白微球，外观表面圆滑，形态规整，不粘连，粒径分布较均匀，罕见凹凸；载药微球形态基本成圆形，规整度较差，微球之间分散好、不粘连，但载药微球表面凹凸现象较严重，在微球表面可观察到少量药物结晶沉积于表面。分析上述实验结果，载药微球形态不规整，可能是成球过程基质材料荷相反电荷基团彼此吸引，在相互凝聚交联沉淀析出时，受到药物头孢曲松荷相反电荷的排斥，以及药物自身在基质材料间成晶状析出，影响到基质材料之间均匀包裹，导致微球表面凹凸不平；空白微球由于不含药物所以表面规整光滑［17］。

    2.3  头孢曲松壳聚糖?海藻酸钠(钙)微球吸水膨胀实验

    以吸水膨胀百分率s为纵坐标，以时间t(min)为横坐标作图，结果见图1。

    由图1所示，该载药微球在10min内迅速吸水膨胀，在50min左右基本达到吸水溶胀平衡。复凝聚法通过正、负电荷基团间静电相互吸引凝聚而成球(Ca2+加入起到交联的作用，因为海藻酸钠是一阴离子多糖，Ca2+的交联促进了两生物多糖的成球作用)，在此过程中长链的多糖分子间相互碰撞缠绕时，分子之间留下许多空隙与孔洞，此类空隙与孔洞的形成为溶剂分子的渗入留下通路，同时由于所用基质材料壳聚糖与海藻酸钠都为生物多糖，富含羟基、氨基、羧基等亲水基团，所以由此类生物多糖形成的亲水凝胶微球吸水能力强，能在短时间内迅速达到溶胀平衡［18］，正是该类水凝胶良好亲水溶胀性能和成球的多孔特征，才能使包载药物从微球基质材料孔隙中缓慢释出。

    2.4  头孢曲松壳聚糖?海藻酸钠(钙)微球体外溶出实验

    根据头孢曲松壳聚糖?海藻酸钠(钙)微球体外溶出实验的体外释放度的测定结果，用累积溶出释药百分比为纵坐标，时间(t/h)为横坐标绘图，结果如图2所示。头孢曲松在1h内迅速释放达30%左右，随后在25h之内头孢曲松从微球凝胶中的释放量呈缓慢均匀增长之势，表明该载药微球缓释效果明显。对累积释药分别以零级动力学方程，一级动力学方程及Higuchi方程进行拟合［19］，前期(0～1h)的释药符合零级释放，拟合方程为Q=31.904t+4.3839(R2=0.9991)， 后期前1h的释药符合零级释放，但K值较大，原因主要是因为在载药微球表面所附着的药物晶体快释所致。在药物晶体暴释之后，溶剂通过微球之间的空隙或管道迅速渗入球体内部，药物逐渐溶解于溶剂而缓慢释放。此外随着水凝胶微球的迅速吸水膨胀，使水凝胶微球内部管道变窄，微球内部的药物只能通过扩散作用，从水凝胶层缓慢的渗出，属于被动扩散过程，该过程符合Higuchi释放机制［20］。由于头孢曲松被包裹成球后，在体内缓慢释放，因此，可以避免用药过程靶标周围酸碱度的急剧变化而导致的β?内酰胺类抗生素药物开环失效，同时也可避免局部药物浓度过高而导致的一系列不良反应。

    3  结论

    本实验在乳化体系中，通过复凝聚法以壳聚糖?海藻酸钠为基质材料，将头孢曲松包裹制成微球，研究了该成球的工艺过程，通过正交统计分析得出最佳工艺条件为壳聚糖与海藻酸钠浓度比为1∶1，pH4.0，反应温度25℃，搅拌速度200r/min。电镜分析和统计表明，该最佳工艺条件所制微球形态良好，尺寸分布合理，弹性较好且具有较高机械强度和表面多孔。本工艺制备的微球再现性好，所制得载药微球性能测试显现吸水溶胀性佳，体外溶出实验表明该微球的释药符合Higuchi方程机制，缓释性能优秀，可望规模性化生产。

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