鲍曼不动杆菌氨基糖苷类修饰酶和I类整合酶基因研究

                       作者：陈琳 蔡挺 张顺 许小敏

【摘要】  目的 了解我院鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，AB)氨基糖苷类修饰酶和I类整合酶基因存在情况。方法 根据美国CLSI/NCCLS 2004年版要求进行抗菌药物敏感性试验，应用PCR技术对AB菌进行氨基糖苷类修饰酶和I类整合酶基因检测。结果 AB菌对13种抗菌药物耐药严重。27株AB菌中氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)?I阳性23株(85.2%)、aac(6′)?I阳性18株(66.7%)、ant(3")?I阳性22株(81.5%)。氨基糖苷类修饰酶基因总检出率为85.2%。I类整合酶基因(intI1)阳性23株(85.2%)。结论 我院AB菌不仅具有多重耐药性，而且氨基糖苷类修饰酶基因、I类整合酶基因携带率高。

【关键词】  鲍曼不动杆菌； 多重耐药； 氨基糖苷类修饰酶； I类整合酶基因

    ABSTRACT  Objective  To study the aminoglycosides modifying enzyme genes and intI gene in Acinetobacter baumannii in Ningbo No.2 Hospital.  Methods  The susceptibility of 13 antibacterials were analyzed according to CLSI (2004) Standards. The aminoglycosides modifying enzyme genes and intI1 gene were detected by PCR.  Results  The multi?drug?resistance of A.baumannii was a serious problem. In 27 strains of A.baumannii, the positive strains of aac(3)?I were 23 strains (85.2%); aac(6′)?I were 18 (66.7%); ant(3")?I were 22 (81.5%) and others were negative. The total detection rate of aminoglycosides modifying enzyme gene was 85.2%. The positive strain of intI1 gene was 23 strains (85.2%).  Conclusions  There were not only multi?drug?resistance but also high percentage of aminoglycosides modifying enzyme gene and intI1 gene in A.baumannii isolated from the hospital.

    KEY WORDS  Acinetobacter baumannii;  Multi?drug?resistance;  Aminoglycosides modifying enzyme; intI1

    不动杆菌属细菌广泛分布于界，也可从人的各种体液、皮肤和粘膜中分离到。由于该属细菌在环境中的存活时间长，因此易于在患者之间播散并引起内感染。鲍曼不动杆菌(A.baumannii，AB)是医院感染的常见菌种之一。氨基糖苷类药物与β?内酰胺类药物联合用药曾是AB菌感染的有效药物，但近年来这二类药物耐药性逐步升高。在革兰阴性菌耐药机制中，I类整合子起着重要的作用，它可携带多种β?内酰胺酶和氨基糖苷类修饰酶基因［1～5］。为了解我院AB菌氨基糖苷类修饰酶基因和I类整合子存在状况，我们对27株AB菌进行了6种氨基糖苷类修饰酶基因(aac(3)?I、 aac(3)?II、 aac(6′)?I、 aac(6′)?II、 ant(3")?I、ant(2")?I)和I类整合子的遗传标记——I类整合酶基因(intI1)检测，现报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  菌株来源

    27株AB菌分离自2005年1月～12月间宁波市第二医院住院患者临床标本，分别为：导管痰10份，痰液9份，腹腔引流液2份，伤口/创面分泌物2份，尿液1份，血液1份，尿导管口标本1份和冷凝水标本1份。全部菌株均使用法国Bio?Merieux公司VITEK?32全自动细菌鉴定仪鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。

    1.2  药敏试验

    采用KB法测定13种抗菌药物的敏感性，并根据美国CLSI/NCCLS 2004年版要求进行抗菌药物敏感性判断。

    1.3  细菌处理

    挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl)，56℃水浴2h，改95℃水浴10min，加入Chelex?100 40μl，离心(15000r/min)30s。上清液即为基因检测的模板液，-20℃冰箱保存备用。

    1.4  基因检测

    基因检测均采用PCR法。各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。PCR扩增体系均为：每反应体系P1、P2引物各0.5μmol/L，dNTPs各200mmol/L，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，Tris?HCl(pH9.0)10mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%(W/V)，Taq DNA聚合酶1U。总反应体积20μl(其中模板液5μl)。PCR热循环参数为： 表1    靶基因PCR引物序列
    93℃预变性2min，然后93℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。PCR试剂盒、阳性对照DNA和PCR引物序列由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

    2  结果

    2.1  抗菌药物敏感性试验

    KB法结果显示，27株AB菌均为多重耐药株。对哌拉西林、头孢吡肟、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星的耐药率均高达88.89%，对哌拉西林/三唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、美罗培南等亦有较高耐药率(表2)。

    2.2  氨基糖苷类修饰酶基因和I类整合酶基因

    27株AB菌中氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)?I阳性23株(85.2%)、aac(6′)?I阳性18株(66.7%)和ant(3")?I阳性22株(81.54%)，其余基因均阴性。氨基糖苷类修饰酶基因总检出率为85.2%。I类整合酶基因intI1阳性23株(85.2%)。图1为部分菌株ant(3")?I基因PCR产物电泳图；图2为intI1基因PCR产物电泳图。与国内其它AB菌氨基糖苷类修饰酶基因和I类整合酶基因检测结果比较见表3。表2    27株AB菌对13种抗菌药物的药敏结

  3  讨论

    2002年1月～12月全国细菌耐药性监测网所属57家三级甲等医院调查显示，AB菌临床分离率为4.2%［6］，并发现AB菌对17种临床常用药物的耐药率在4.3%～86.9%之间。上海地区1995年～2003年不动杆菌属临床分离状况为：9年间共分离不动杆菌属菌株10992株，其中90.3%来自住院患者。不动杆菌在非发酵菌中所占比例为35%～37%，其中AB菌约占同年不动杆菌属总数的72.3%～78.6%［7］。解放军301医院对呼吸机相关肺炎的病原学和耐药性监测  表3 与国内其它医院AB菌氨基糖苷类修饰酶基因和I类整合酶基因检测结果比较ND：未检测。

    发现AB菌分离率达11.5%，对15种临床常见药物的耐药性更高达10.5%～100%之间［8］。β?内酰胺类和碳青霉烯类抗菌药物曾经是AB菌感染的有效药物，近年来，由产β?内酰胺酶AB菌引起的感染发病率在逐年提高，暴发或流行也时有发生［1～9］，宁波市第二医院已分离到同时产blaTEM、blaOXA?23群、blaADC等β?内酰胺酶的AB菌(另文报道)。

    氨基糖苷类药物自1944年首次发现链霉素以来，因抗菌谱广、疗效显著，在医学临床和畜牧兽医业得到广泛应用，但泛用和过度使用其耐药问题随之凸现，细菌对该类药物耐药是通过产氨基糖苷类修饰酶(aminoglycoside?modifying enzyme，AME)、细菌16S rRNA基因甲基化酶(编码基因为rmtA)和氨基糖苷类药物作用靶位16S rRNA基因(16S rDNA)突变而致，其中前者为主要原因。氨基糖苷类修饰酶按功能可分成乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶(ANT)［曾称腺苷转移酶(AAD)］三类，目前已发现的有30余种［9］。本研究发现宁波市第二医院AB菌不仅具有多重耐药性，而且aac(3)?I、aac(6′)?I和ant(3")?I氨基糖苷类修饰酶编码基因携带率高(总检出率为85.2%)，与庆大霉素、阿米卡星的高耐药性(耐药率均为88.89%)相近。整合子是继转座子之后新发现的可移动基因元件，它不仅可携带多种β?内酰胺酶和氨基糖苷类修饰酶基因，而且更易在同种细菌和不同种类细菌中进行基因的水平转移，使细菌的耐药性得以快速传播［10］。在耐药机制中，I类整合子最常见并起着非常重要的作用，5′保守端有编码整合酶的intI1基因(1009bp)及启动子，其整合酶是含有337个氨基酸的蛋白，3′末端为耐消毒剂和磺胺基因(qacE△1?sul1)。intI1与qacE△1?sul1均为I类整合子的遗传标记，本组27株AB菌intI1检出率85.2%，携带I类整合子可能是导致其高耐药性的原因。

【】
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