铜绿假单胞菌I类整合子相关基因的解析和定位
来源：岁月联盟
时间：2010-07-11
【摘要】 目的 对4株铜绿假单胞菌临床菌株携带的I类整合子相关基因进行解析和定位，探讨I类整合子相关基因在细菌耐药性形成和耐药基因播散中的作用。方法 采用PCR扩增、DNA测序、DNA序列比对的方法对4株铜绿假单胞菌临床菌株携带的I类整合子相关基因进行解析，采用接合试验对该类整合子进行定位分析。结果 4株铜绿假单胞菌I类整合子都含有耐药基因，该耐药基因在相应菌株中发挥耐药作用；该菌整合子位于质粒上。结论 I类整合子耐药基因在铜绿假单胞菌耐药性形成和耐药基因的播散中发挥作用。
【关键词】 铜绿假单胞菌； I类整合子； 耐药基因
ABSTRACT Objective Drug resistance genes associated with class I integron and their allocation in Pseudomonas aeruginosa were analyzed. Methods PCR screening and DNA sequence were used to determine the drug resistance genes associated with class I integron in 4 clinical strains of P.aeruginosa. The resistance genes were located by conjugated transfer experiments and the conjugations were studied by PCR method. Results Four clinical strains of P.aeruginosa carried drug resistance genes associated with class I integron, which played the drug resistant role in the clinical isolates and were located in plasmid. Conclusion Drug resistance genes associated with class I integron played the drug resistance and class I integron carried by plasmid were widespread easily in clinical isolates of P.aeruginosa.
KEY WORDS Pseudomonas aeruginosa; Class I integron; Drug resistance gene
整合子(integron，int)是一种细菌基因捕获和表达的遗传单位，它在细菌多重耐药的形成和耐药基因的水平播散中的作用引起了研究者的广泛关注［1～3］。整合子通过整合酶从环境中捕获耐药基因盒，并将耐药基因盒组装在一起，形成巨大的耐药基因多基因座；同时整合子及耐药基因盒可借助转化、转导及接合等方式在细菌中转移，使耐药基因广泛传播。整合子携带的耐药基因遗传稳定性较高、不易丢失，有利于细菌耐药基因的积累，在细菌多重耐药性的形成中起重要作用。I类整合子在铜绿假单胞菌中分布广泛［2～4］，本文对铜绿假单胞菌临床分离株携带的I类整合子相关基因进行解析与定位，以期进一步探讨整合子在细菌耐药中的作用。
1 材料和方法
1.1 菌株
已鉴定4株铜绿假单胞菌临床菌株(PA107、PA113、PA114和PA215)携带I类整合子及整合子相关基因盒(本实验室保存)。质控菌为铜绿假单胞菌ATCC27853(购自药品生物制品检定所)。对利福平耐药的整合子阴性大肠埃希菌RG488。
1.2 药敏试验
选用10种常用抗生素(哌拉西林、头孢哌酮、头孢曲松、妥布霉素、庆大霉素、链霉素、左氧氟沙星、复方磺胺甲口恶唑和利福平)，按照美国临床实验室标准化研究所2000年版纸片扩散法，对上述4株铜绿假单胞菌进行药敏试验。质控菌铜绿假单胞菌ATCC27853与检测菌株平行进行药敏试验。
1.3 铜绿假单胞菌I类整合子相关基因盒DNA序列分析
(1)DNA模板的制备 将上述4株铜绿假单胞菌分别接种于LB培养基中37℃过夜培养；取菌液50μl，悬浮在450μl双蒸水中，沸水浴10min后立即放至冰中冷却，稍后离心，上清液为粗提DNA，-80℃保存。
(2)I类整合子相关基因盒扩增和测序以I类整合子两端高度保守序列设计引物(5′-GGCATCCAAG-CAGCAAGC-3′和5′-AAGCAGACTTGACCTGAT-3′)，扩增上述4株铜绿假单胞菌I类整合子的可变区(包含整合子相关基因)。PCR反应体系为10×PCR缓冲液5μl、dNTP(均为2.5mmol/L)4μl、in-F和in-B各3μl、rTaq(5U/μl，TAKARA生物工程公司)0.25μl、模板DNA 2μl，加无菌双蒸水至50μl。PCR条件：94℃变性5min；94℃30s，52℃ 1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸7min。使用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒提纯上述PCR产物，并将其在ABI PRISM 310测序仪上进行双向测序(委托上海生工生物工程有限公司完成)。
(3)I类整合子相关基因盒DNA序列分析 通过www.ncbi.nlm.nih.gov网站，登陆美国国家生物技术信息中心GenBank DNA数据库，应用Standard nucleotide nucleotic BLAST软件对所测得的上述4株铜绿假单胞菌I类整合子相关基因盒的DNA序列进行同源性比对分析，用DNA Star5.0软件对DNA序列进行开放读码框(open reading frame，ORF)分析，确定整合子基因盒中所含的耐药基因。 1.4 I类整合子的定位
(1)接合转移试验 以对利福平耐药的整合子阴性大肠埃希菌RG488(E.coli RG488，Rifr+)做受体菌，以上述整合子耐药基因明确的4株铜绿假单胞菌做供体菌，进行接合转移试验。根据供体菌的耐药表型和所携带的整合子相关耐药基因的特性，确定与其整合子耐药基因相关的耐药标志，同时考虑受体菌的耐药标志，选择两种抗生素，加入沙门菌志贺菌(SS)肠道选择鉴别培养基中，制备含双抗的SS肠道选择鉴别培养基，筛选接合转移试验的接合子。
(2)接合子I类整合子相关基因的检测 提取接合子的总DNA，PCR扩增接合子I类整合子相关基因，方法同1.3；比较接合子与供体菌I类整合子相关基因PCR扩增产物的大小。
2 结果
2.1 药敏试验
4株铜绿假单胞菌临床菌株对所选十种抗生素都表现出不同程度的耐药，结果见表1。
2.2 I类整合子相关耐药基因DNA序列分析
铜绿假单胞菌PA107、PA113、PA114和PA215的Ι类整合子相关基因盒DNA序列都含有ORF，除一个ORF为功能不明基因(orfF)外，其它ORF都为耐药基因，如dhfrXII为二氢叶酸还原酶基因，介导对甲氧苄氨嘧啶和链霉素耐药；aadA2为链霉素3”-表1 铜绿假单胞菌的药敏试验结果
腺苷酰基转移酶基因，介导对链霉素和大观霉素耐药；aadA4基因编码氨基糖苷腺苷酰(基)转移酶，介导对链霉素耐药；aadB基因编码氨基糖苷腺苷酰(基)转移酶，介导对庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素耐药。其中I类整合子可变区大小相近的，含有的耐药基因相同；大小不同的，耐药基因则不同(表2)。药敏试验表明这4株菌整合子相关的耐药基因在细菌耐药中发挥作用。表2 铜绿假单胞菌I类整合子相关耐药基因的解析及定位
2.3 I类整合子相关耐药基因的定位分析
在以I类整合子基因盒阳性菌PA107、PA113、PA114和PA215为供体菌，以大肠埃希菌RG488为受体菌的四组接合转移试验中都产生了具有供体菌整合子相关的耐药表型的接合子。接合子的I类整合相关基因PCR扩增产物的大小与相应供体菌相同，表明接合子获得了供体菌含有相应耐药基因的I类整合子，即以上4株铜绿假单胞菌的I类整合子位于质粒上，该质粒为接合型质粒(表3)。
3 讨论
目前研究报道I类整合子可变区大小在l～3kb之间，所含耐药基因介导的抗生素耐药基本覆盖了使用的大多数抗菌药物，常见的有氨基糖苷类耐药基因、甲氧磺胺嘧啶类耐药基因、β-内酰胺酶基因等，它们即可单独存在，也可以不同的组合方式存在于同一个整合子中［1］。本研究检测的4株铜绿假单胞菌携带的I表3 供体菌的耐药特性及筛选接合子的抗生素类整合子所携带的耐药基因，属于上述常见的耐药基因，如dhfrXII、aadA2、aadA4基因；药敏试验表明这些耐药基因在该菌的耐药中发挥作用。本研究检测的4株铜绿假单胞菌还表现对左氧氟沙星、头孢哌酮、头孢曲松和哌拉西林耐药，相应的耐药基因未在整合子上发现，提示该菌可能具有其它耐药机制，如细菌的低渗透性、酶的修饰作用等，也不排除该菌有其它类型整合子的存在。
整合子的流行病学研究发现一些广泛分布的优势整合子，如Martinez-Freijo等［5］从欧洲9个国家分离的13种肠杆菌科细菌中发现，整合子可变区大小为800、1000和1500bp的I类整合子最常见；尽管菌株的地域来源或菌株的种属存在差异，但若整合子基因簇的大小相同，通常所含的耐药基因也相同，如约800bp的基因簇中含有aacA4或aadB基因，约1000bp的含有aadA4基因，约1500bp的则包含dfrl和aadA1基因。本研究所检测的整合子基因簇的特性与上述的报道一致，属于广泛分布的优势整合子。在与美国国家生物技术信息中心GenBank DNA数据库中的DNA序列的比对时发现，本研究中4株菌I类整合子可变区的DNA序列与分离自不同国家、不同地区、不同菌属的细菌整合子基因盒相关序列有99%的同源性，这些菌株的整合子多位于质粒或转座子上，本实验中检测的4株菌的整合子也位于质粒上。以上信息提示具有该类基因簇的整合子通常位于质粒或转座子上，能在同种或不同种属的细菌间活跃转移，成为在细菌中广泛存在的优势整合子。报道的整合子也多位于质粒上［1，6］，提示质粒在细菌间的转移在整合子的播散中发挥作用。
随着抗生素应用的变化，耐药基因的种类和数量也将发生相应的变化。新形成的耐药基因一旦被整合子捕获，就有可能在细菌间广泛播散，在细菌中形成对新抗生素的普遍抗性。深入研究整合子在细菌耐药性形成和播散中的作用机制，对监控耐药菌株的流行趋势，为临床控制细菌耐药性形成和播散提供依据。
【文献】
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