耐头孢哌酮/舒巴坦鲍曼不动杆菌的分子流行病学调查

【摘要】  目的 调查重庆某三甲2004年11月至2005年9月显著增多的耐头孢哌酮/舒巴坦鲍曼不动杆菌之间的同源性，了解是否有该耐药株暴发流行。方法 用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对28株具有相同耐药模式的耐头孢哌酮/舒巴坦鲍曼不动杆菌进行分型，明确其是否为同一菌株的克隆。结果 28株鲍曼不动杆菌PFGE图谱分为A(A1、A2、A3)、B(B1、B2)、C、D、E五型，其中主要流行型A1亚型11株，流行型B1亚型9株，剩余8株中A2亚型2株，A3亚型2株，B2亚型1株，C型2株，E型1株。A1亚型和B1亚型来源于呼吸科，并在外科病区的胸外科、脑外科、肝胆外科已存在9个月左右；A2亚型、A3亚型、B2亚型和C型2株于2005年6月开始出现于胸外科和肝胆外科。结论 2004年11月至2005年9月该院出现了由2个克隆株引起耐头孢哌酮/舒巴坦鲍曼不动杆菌的暴发流行，结合临床资料和科室地理位置分析，医务人员的手污染可能是引起本次暴发感染的重要感染源和感染途径。

【关键词】  不动杆菌属； 头孢哌酮/舒巴坦； 耐药性； 脉冲场凝胶电泳

    ABSTRACT  Objective  To learn an outbreak of Acinetobacer baumannii by investigating the homogeneity of the unusually increasing cefoperazone/sulbactam -resistant Acinetobacer baumannii isolates from November 2004 to September 2005 in a hospital in Chongqing.  Methods  The pulse-field gel electrophoresis (PFGE) was used for genotyping of 28 strains of Acinetobacer baumannii with the same resistance pattern and determining whether they derived from the same clone.  Results  Twenty eight strains were classified into 5 types based on PFGE profiles, named type A (A1, A2 and A3), B (B1 and B2), C, type D and E. There were 11 strains typing A1 and 9 strains typing B1 respectively, and the rest were identified: two in type A2, two in type A3, one in type B2, two in type C and one in type E. Both type A1 and type B1 originated from respira-tory department were transmitted to deparments of cerebral surgery, chest surgery and hepatobiliary surgery during 9 months, while type A2, type A3, type B1 and type C have existed in departments of chest surgery and hepatobiliary surgery since June 2005.  Conclusions  An outbreak of cefoperazone/sulbactam -resistant Acinetobacter baumannii infection occurred in our hospital from November 2004 to September 2005, which was caused by two major clones, type A and type B. Combined with clinical data and epidemic location, the investigation showed that contaminated hands of staffs may be the infective origin and the route of transmission.

    KEY WORDS  Acinetobacter;  cefoperazone/sulbactam;  Resistance;  PFGE

    鲍曼不动杆菌是院内感染的重要病原菌，在医院环境中可长期存在，特别是机体抵抗力下降或免疫功能受损时更易出现相关的院内感染。由于存在多种耐药机制，临床常表现为多重耐药性。头孢哌酮/舒巴坦对鲍曼不动杆菌有良好的体外抗菌活性，而且对近年出现的碳青霉烯类耐药株也部分敏感［1］，被认为是鲍曼不动杆菌感染的优选药物。

    2004年11月至2005年9月，重庆某三甲医院在执行细菌耐药监测计划研究中发现该院分离的鲍曼不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦耐药率较其它单位明显偏高，敏感率仅为36.8%(25/68)，其中有28株菌表现为相同的耐药模式：仅对亚胺培南和美罗培南敏感，而对包括头孢哌酮/舒巴坦在内的第三代头孢菌素、氨基糖苷类和喹诺酮类耐药。为证实这些菌株之间可能存在医院内小范围的暴发，用公认的判断细菌同源性金标准-脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行基因分型，并结合临床资料和耐药模式，了解感染源头及感染途径。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    (1)菌株  收集2004年11月至2005年12月重庆某三甲医院临床分离的具有相同耐药模式的、头孢哌酮/舒巴坦耐药而亚胺培南和美罗培南敏感的鲍曼不动杆菌28株(排除同一患者同一部位重复分离的菌株)，以同一时期的对头孢哌酮/舒巴坦敏感的鲍曼不动杆菌301号为阴性对照株。菌种鉴定采用VITEK2系统(Bio-Merieux，法国)及常规生化方法。

    (2)仪器与试剂  CHEF-Mapper XA型脉冲电泳仪购于美国Bio-Rad公司；蛋白酶K为GIBCOBRL公司产品；ApaI为Promega产品；所有药敏纸片购自BD公司。

    (3)临床调查  回顾性分析了28例患者的病例资料，了解其基本情况、所患疾病、诊疗经过、细菌学检查等。

    1.2  方法

    脉冲场凝胶电泳(PFGE)操作过程参照Seifert报道方法［2］，略加改进。①细菌DNA原位纯化：将细菌与等体积2%低熔点琼脂糖混匀后注模，成型凝胶块分别经蛋白酶K溶液裂解、PMSF溶液处理后，置于4℃过夜；②限制性内切酶原位消化：将原位纯化的凝胶块切成一定大小薄片，加入含50IU ApaI的孵育缓冲液37℃酶切过夜；③上样：采用梳齿上样法，将消化好的样本凝胶块和λ条带标记物(CHEF DNA size standard，Bio-Rad)凝胶块上样于1%电泳琼脂糖凝胶；④电泳：使用CHEF MapperXA电泳系统(Bio-Rad)。电泳条件：6v/cm，22h，脉冲时间5～20s，角度120°；⑤染色及图像采集：凝胶于0.25mg/ml溴化乙锭中染色漂洗后，采用凝胶成像系统(Bio-Rad)采集凝胶DNA指纹图像；⑥菌株DNA同源性判定标准：参照Tenover等［3］的肉眼判定标准：a)无法区分：0条带不同；b)紧密相关：2～3条带不同；c)有可能有关：4～6条带不同；d)不同：≥7条带不同。带型差异≤3条带的菌株被认为基因组高度同源，属同一克隆，在流行病学上密切相关。

    2  结果

    2.1  临床资料调查结果

    28株耐头孢哌酮/舒巴坦鲍曼不动杆菌来源于三个不同的病区：外科病区16株，传染呼吸病区10株，内科病区2株；其中来自监护病房(ICU)13株，来自普通病房15株；23株来源于痰标本(含1份气管抽吸物)，2株来源于尿标本，2株来源于脓液，1株来源于伤口分泌物。所有患者都存在以下一种以上严重的基础疾病：呼吸衰竭、慢性阻塞性肺气肿、肺癌、脑出血、脑挫裂伤、肝移植术后和胸腹腔大手术等。所有患者在药敏结果出来之前使用过头孢哌酮/舒巴坦。

    2.2  PFGE结果

    ApaI可将鲍曼不动杆菌DNA切成约15条以上条带。阴性对照301号有7条以上不同条带，故可断定与其余各株无关(图略)。28株鲍曼不动杆菌分为A(A1、A2、A3)型15株、B(B1、B2)型9株、C型2株、D型1株、E型1株，A型中有11株条带完全一致，为同一克隆株，定义为A1亚型；有2株条带完全一样，与A1相差1个条带，定义为A2亚型；有2株菌与A1、A2相差2～3个条带，定义为A3亚型。按同样标准，B型有B1亚型8株，B2亚型1株(图1)。

    2.3  菌株临床分布与基因分型的关系

    由表1可见，在调查的11个月中，该院存在耐头孢哌酮/舒巴坦鲍曼不动杆菌的暴发流行。主要表现为两个大流行株：A型和B型，两者占调查菌株的85.7%，其中A1亚型和B1亚型占67.9%。A型和B型主要分布于传染呼吸病区的呼吸科和外科病区的脑外科、胸外科及肝胆外科。A1亚型主要出自于呼吸科监护病房(RICU)，存在时间达半年，并于出现3个月后传播至外科病区的脑外科，从2005年2月至2005年8月，导致胸外科、脑外科和肝胆外科的暴发流行。A2亚型则在两个月的时间里流行于肝移植术后患者所住的肝胆外科监护病房。B1亚型最先流行于呼吸科，出现半年后，成为胸外科和肝胆外科的主要流行株，而且主要集中于1个月的时间中。2株C型和1株表1        28株鲍曼不动杆菌的流行病学数据F型仅见于外科病区，并都出现于2005年7月。

    3  讨论

    近年来，多重耐药鲍曼不动杆菌所致的院内感染正日渐引起关注，特别是碳青霉烯类耐药株和对所有药物耐药的泛耐株(pan-drug resistance，PDR)的出现，使临床面临的挑战更加严峻。头孢哌酮/舒巴坦由于药物中舒巴坦对不动杆菌属细菌有独特的杀菌作用，临床中常作为首选药物之一。

    最近的CHINET监测发现，与北京、上海、杭州地区的数据相比，该院临床分离的鲍曼不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率明显偏高，而且大多菌株表现为相同的耐药模式，即仅碳青霉烯类敏感，对其他抗菌药物均耐药，这种现象与该院前几年的监测情况也不一致［4］。为此，我们对这些耐药株进行分子流行病学分析。实验结果表明，该院从2004年11月至2005年9月存在头孢哌酮/舒巴坦耐药的鲍曼不动杆菌暴发流行。

    研究显示，该院的鲍曼不动杆菌耐药流行株存在时间跨度长、分布科室相对集中、有新流行株出现趋势等特点。

    28株耐药株中的两个主要流行株A型和B型，流行时间均达9个月多，横跨了整个调查采样时段，并且从传染呼吸病区传播至外科病区。Jawad等报道［5］不动杆菌不同于其它革兰阴性杆菌，它可在干燥环境中长期生存，并通过空气传播引发暴发流行。Gerner-Smidt［6］的一项临床调查显示，1株乙酸钙不动杆菌在两年中共引起了111位住院患者的细菌定植，且8%～13%职工的手上都检到该菌株。Wendt等［7］实验进一步发现，分离于院内获得性肺炎(HAP)痰中的鲍曼不动杆菌流行株较其它来源的流行株生存时间更长，其在干燥环境中可存活4个月。这个结果与我们的调查一致，两个主要亚型A1和B1都出自呼吸科HAP患者的痰中。在调查截止日期，A1和B1流行株仍分别在胸外科两位HAP患者痰标本分离到，来源于两位泌尿道感染患者的A1流行株都只出现于同一个月，之后再未发现。同样的情况也见于2例伤口和脓液分离的B1流行株。

    此次鲍曼不动杆菌耐药暴发流行的另一个特点是流行科室相对集中。所有28株耐药株都集中在2个病区4个科室，两个主要流行株A1亚型和B1亚型也局限于这4个科室。呼吸病区和外科病区直线距离约200米，胸外科和脑外科相隔一层楼，他们与肝胆外科相隔3层楼。而未出现耐药株流行的感染科居于呼吸科楼下，内科病区与外科病区仅距5米左右，这些地理位置紧邻暴发流行地的病区和科室为何免遭波及？我们推测可能和医务人员的手传播有关。不动杆菌被国外学者称为“革兰阴性MRSA”［8］，意指该菌不仅有多重耐药性，而且如MRSA一样在环境中生存力强。如前所述，其可在干燥环境中长期生存，除了空气外，病床扶手、枕头、被褥、听诊器和白大衣上都可长期存在，而医务人员的手是重要的传播介质［9］。该院脑外科、胸外科和肝胆外科是请呼吸科会诊次数最多的科室，由于呼吸科是两个主要流行株的源头，虽然两病区地理位置相距较远，但细菌通过会诊人员的手或听诊器的传播，引起外科这些具有高危因素的患者感染；被会诊者主要科室总住院医师由同一人担任，加大了流行株在外科几个科室传播的可能。这个推测也被另外两个现象所证实：①与呼吸科同一病区的感染科未发生流行；②外科病区发现耐药株流行时，曾多次作空气培养，未检测到鲍曼不动杆菌。提示该院的流行株不是以空气为主要传播介质。研究还发现，A1流行株主要发生于4月份，B1流行株主要发生于6～8月，这正是重庆地区气候较热、湿度较大的季节，有利于鲍曼不动杆菌在手上定植较长时间［5］。此外，鲍曼不动杆菌较阴沟肠杆菌和黏质沙雷菌更能耐受一般的洗手消毒剂如肥皂、洗必泰［10］，仅次氯酸盐有较好消毒效果。国外研究已证实，某些消毒剂是金葡菌多重耐药株(MDR)的外排底物，使MDR株较普通株更能耐受消毒剂［11］，虽然此类研究尚未在鲍曼不动杆菌中加以证实，但我们调查的3株对多药敏感的鲍曼不动杆菌均为独立基因型，不排除鲍曼不动杆菌多重耐药株对消毒剂更耐受的可能。

    原有流行株可能继续存在，而且有新流行株出现的趋势，这是该院鲍曼不动杆菌耐药株的第三个特点。至本次调查截止期，A1和B1亚型仍在胸外科存在，肝胆外科出现了A2亚型。鉴于鲍曼不动杆菌耐药株的特殊生物学特性，这两个流行株可能还继续存在一段时间，我们将密切关注。另外，2005年7月在肝胆外科ICU出现了C型流行株，胸外科出现了独立的F型，它们是否会成为以后时期的流行源头，有待进一步追踪。

    本课题研究提示，近年该院临床分离的鲍曼不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率明显偏高，与院内出现克隆株暴发流行有关。值得注意的是，相同耐药模式的28株菌由5个基因型组成，提示这些菌株之间的耐药机制可能不尽相同。因为细菌的耐药模式分型属于表型分型方法，并不十分准确。耐药质粒的获得与丢失，环境中是否存在着表达诱导因素等诸多因素都可影响耐药表型的表达［12］。

【】
  ［1］ 杨青，徐小微，俞云松，等. 碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌流行病学及碳青霉烯酶类型的研究［J］. 中华检验医学杂志，2003，26(6)：342

［2］ Seifert H, Gerner-Smidt P. Comparison of ribotyping and pulsed-field gel electrophoresis for molecular typing of Acinetobacter isolates ［J］. J Clin Microbiol,1995,33(5):1402

［3］ Tenover F C, Arbeit R D, Goering R V, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing ［J］. J Clin Microbiol,1995,33(9):2233

［4］ 卓超，黄文祥，郑行萍. 六年监护病房中革兰阴性杆菌的耐药性变迁［J］. 中华检验医学杂志，2004，27(11)：752

［5］ Jawad A, Heritage J, Snelling A M, et al. Influence of relative humidity and suspending menstrua on survival of Acinetobacter spp. on dry surfaces ［J］. J Clin Microbiol,1996,34(12):2881

［6］ Gerner-Smidt P. Endemic occurrence of Acinetobacter calcoaceticus biovar anitratus in an intensive care unit ［J］. J Hosp Infect,1987,10(4):265

［7］ Wendt C, Dietze B, Dietz E, et al. Survival of Acinetobacter baumannii on dry surfaces ［J］. J Clin Microbiol,1997,35(6):1394

［8］ Beggs C B, Kerr K G, Snelling A M, et al. Acinetobacter spp. and the clinical environment ［J］. Indoor Built Environ,2006,15(1):19

［9］ Wang S H, Sheng W H, Chang Y Y, et al. Healthcare associated outbreak due to pan-drug resistant Acinetobacter baumannii in a surgical intensive care unit ［J］ . J Hosp Infect,2003,53(2):97

［10］ Penna T C, Mazzola P G, Silva Martins A M. The efficacy of chemical agents in cleaning and disinfection programs ［J］. BMC Infect Dis,2001,1(1):16

［11］ Alam M M, Kobayashi N, Uehara N, et al. Analysis on distribution and genomic diversity of high-level antiseptic resistance genes qacA and qacB in human clinical isolates of Staphylococcus aureus ［J］. Microb Drug Resist,2003,9(1):109

［12］ Olive D M, Bean P. Principles and applications of methods for DNA based typing of microbial organisms ［J］. J Clin Microbiol,1999,37(6):1661