新疆地区鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因研究
【摘要】 目的 了解20株鲍曼不动杆菌(A.baumannii，AB)β-内酰胺酶基因存在状况。方法 用PCR方法对20株AB菌的9种β-内酰胺酶基因进行检测。结果 20株AB菌中blaTEM阳性13株(65%)、blaADC阳性12株(60%)、blaSHV阳性1株(5%)，其余β-内酰胺酶基因均阴性；1株blaSHV测得序列经比对为blaSHV-36型；1株blaADC作全长基因测序，测得序列经比对与美国核酸库已登录的blaADC DNA序列均不同，为新亚型。结论 该20株AB菌对β-内酰胺类抗生素耐药与产β-内酰胺酶密切相关。
【关键词】 鲍曼不动杆菌； β-内酰胺酶；耐药基因
ABSTRACT Objective To investigate the encoding genes of β-lactamases on 20 strains of Acinetobacter baumannii isolated in Xinjiang province. Method Twenty strains of A.baumannii were isolated from hospitalized patients, and 9 kinds of β-lactamases genes were detected. Results The detection rates of β-lactamasesen coding genes of blaTEM, blaADC and blaSHV groups were 65%, 60% and 5% respectively, and the others were not found in all the tested isolats. With sequencing and alignment, the PCR amplification product of blaSHV was identified as blaSHV-36. The full sequence of one β-lactamase ADC strain was different with that of β-lactamase ACD GenBank, and it was a new subtype. Conclusions Drug-resistance of the 20 strains to β-lactam were closely related with β-lactamases.
KEY WORDS Acinetobacter baumannii; β-lactamases; Resistant gene
鲍曼不动杆菌(A.baumannii，AB)为腐生菌，广泛分布于界，也可从人体皮肤分离到。AB菌产β-内酰胺酶(β-lactamases)导致感染的暴发或流行时有发生。国外报道从AB菌得到blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaPER、blaVEB、blaCTX-M、blaCARB、blaIMP和blaVIM等β-内酰胺酶基因［1～11］。我国从β-内酰胺类耐药AB菌得到blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaPER、blaDHA、blaGES、blaVEB、blaIMP和ampC等β-内酰胺酶基因［12～22］。为了解我院AB菌临床分离株中β-内酰胺酶基因存在状况，我们对20株AB菌进行了blaTEM、blaSHV、blaPER、blaVEB、blaGES、blaCARB、blaCTX-M-1群、blaADC和blaDHA等9种β-内酰胺酶基因检测，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 20株AB均分离自2006年9月～2006年12月间我院住院患者临床标本，其中痰液11份，尿液4份，血液5份。全部菌株均使用VITEK—TWO细菌鉴定仪鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。
1.2 抗菌药物敏感性试验
为微量肉汤稀释法和KB法测定23种抗菌药物的敏感性，并根据美国CLSI 2006年版要求进行敏感性判断。
1.3 细菌处理
挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl)，56℃水浴2h， 改95℃水浴10min，加入Chelex-100 40μl，离心(15000r/min)30s。上清液即为基因检测的模板液，-20℃冰箱保存备用。
1.4 基因检测
基因检测全部采用PCR法，各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。blaADC作全长基因扩增测序引物为5′-ATGCGATTTAAAAAAATTTC-TTGTC/TTA-3′，5′-TTATTTCTTTATTGCAT-TCAGCACAA/GC-3′。各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P1、P2引物各0.5μmol/L，dNTPs各200mmol/L，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，Tris-HCl(pH9.0) 10mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%(wt/vol)，Taq DNA pol 1U。总反应体积20μl(其中模板液5μl)。热循环参数(PCR产物长度>500bp)为：93℃预变性2min，然后93℃ 60s→55℃ 60s→72℃ 60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min，其余均为：93℃预变性2min，然后93℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。
2 结果
2.1 抗菌药物敏感性试验
用微量肉汤稀释法和KB法测定24种抗菌药物的敏感性，结果见表2。
2.2 耐药基因的扩增
(1)各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。表1 靶基因PCR引物序列表2 20株AB菌对23种抗菌药物的敏感性(2)20株AB菌中blaTEM阳性13株(65%)，blaADC阳性12株(60%)，blaSHV阳性1株(5%)，其余基因均阴性。1株blaSHV测得序列经美国核酸库［www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide］比对为blaSHV-36型；1株blaADC作全长基因测序，测得序列经比对与美国核酸库已登录的blaADC DNA序列均不同，可判为新亚型。
3 讨论
本组20株AB菌经9种β-内酰胺酶基因检测以携带blaTEM和blaADC为主。blaADC型β-内酰胺酶基因过去国内的研究报道很少涉及［2～26］，近期亦有阳性菌株的报道但相关未作全长基因测序［27，28］。blaADC型β-内酰胺酶为不动杆菌特有的AmpC酶，故被命名为Acinetobacter-derived cephalosporinases，ADC［29］。我们对1株blaADC作全长基因测序，测得序列经比对与美国核酸库已登录的blaADC DNA序列均不同，该株测得blaADC DNA序列与美国核酸库已登录的blaADC家族DNA序列分子进化分析呈独立一型。将该株测得blaADC DNA序列翻译成氨基酸序列与美国核酸库已登录的blaADC氨基酸序列比较，与gi|7258342|emb|CAB77444.1|最接近，但仍有2个氨基酸差别。故可判为新亚型。1株blaSHV测得序列经比对为blaSHV-36型亦为国内首次报道。本研究发现新疆鲍曼不动杆菌β-内酰胺类耐药表型与β-内酰胺酶基因检测状况基本相符。
值得一提的是在进行某种耐药基因家族PCR检测之前，要设计(或采用)保守性较好的PCR引物，以便检出各亚型。β-内酰胺酶不仅种类繁多(已报道的基因家族已近150种)，而且同一基因家族亚型颇多，新亚型仍不断被发现。据β-内酰胺酶专门网页报道(www.lahey.org/studies，截止于2006年11月27日)，blaTEM基因家族已有155种亚型，blaSHV基因家族的亚型均超过90种亚型；在美国核酸库［www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide］登录的blaADC家族已有24种亚型。所以检测之前要确保所采用的PCR引物序列保守性(检测的通用性)是较好的。以便检出各亚型甚至及时发现新亚型［30］。
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