以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核分枝杆菌药物

【摘要】  进入21世纪，结核病仍然是临床上发病率和死亡率最高的传染病之一。目前，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的多重耐药，以及在抗结核药物作用过程中结核分枝杆菌的持留状态，已成为全世界结核病控制工作的主要障碍。异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase，ICL)是乙醛酸循环途径中的关键限速酶之一，决定了结核分枝杆菌的持留性。在文中我们将描述异柠檬酸裂解酶的基本性质及结构特征，希望能通过对ICL抑制剂作用区域的了解来推动抗持留结核分枝杆菌药物的研究。

【关键词】  异柠檬酸裂解酶； 结核分枝杆菌； 持留状态

    ABSTRACT  Getting into the 21st century, tuberculosis remains a leading cause of mortality worldwide. The main obstacles to the global control of the disease are emerging multi-drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis and the recalcitrance of persistent infections to treatment with conventional anti-TB drugs. Isocitrate lyase (ICL) is a key rate-limiting enzyme in the glyoxylate bypass, and it is needed for persistent Mycobacterium tuberculosis to get energy. Consequently, isocitrate lyase is an attractive targets for the development of new antituberculosis agents. In this paper, the characteristion and structure of ICL were decribed. Our understanding of the inhibitor-bound sites will provide a springboard to find drugs which target the tuberculosis infection.

    KEY WORDS  Isocitrate lyase;  Mycobacterium tuberculosis;  Persistent infections

    结核分枝杆菌的持留状态是结核病的瓶颈之一。处于持留状态的结核分枝杆菌，其生长速度极为缓慢甚至不生长，以此来躲避抗结核药物的攻击。人体的免疫系统及现有的抗结核药物可以迅速杀死处于生长状态的结核分枝杆菌，但对于处在非生长状态的持留结核分枝杆菌却无能为力。一旦患者的免疫力下降或停止用药，持留结核分枝杆菌将大量生长繁殖，重新处于活跃的致病状态［1，2］。这是全球防治结核病工作的主要障碍之一。因此，我们迫切需要研发出新型的抗结核药物，特别是对持留状态的结核分枝杆菌有杀灭作用的药物。此类药物的研制对缩短结核病的治疗时间，降低耐多药结核病的发生，减少结核病的复发和患者的再感染几率有着极为重要的意义。    近年来，研究学者在结核分枝杆菌的持留性发生和保持机制方面取得了一些进展，这些研究成果将对新型结核药物的研发有重要的推动作用。

    1  持留结核分枝杆菌在巨噬细胞中存活

    不同于其他通过逃避吞噬而致病的细菌，结核分枝杆菌能通过多种机制，利用宿主细胞表面的多个受体(包括甘露糖受体、补体受体、和Fc受体)进入巨噬细胞，并在巨噬细胞内存活。研究显示，宿主细胞表面的甘露糖受体能选择性的结合结核分枝杆菌H37Rv毒株，并且该受体的表达能被γ干扰素下调，因此在结核分枝杆菌感染早期的摄入中可能发挥重要作用［3］。

    巨噬细胞可以产生具有抗微生物活性的活性氧或活性氮，抵抗巨噬细胞的杀伤是结核分枝杆菌毒力的关键［4］。结核分枝杆菌有两种编码超氧化物歧化酶蛋白的基因sodA和sodC。sodA编码锰、铁超氧化物歧化酶，它是结核分枝杆菌大量分泌的胞外蛋白之一。sodC编码铜、锌超氧化物歧化酶，其分泌量较少。超氧化物歧化酶(SOD)的功能是将O2-转变成分子氧和过氧化氢，消除O2-的毒性作用，并且可以通过其他反应防止大量过氧化氢的产生。SodA和SodC蛋白能帮助结核分枝杆菌防止超氧化物的毒性作用以及抵抗活性巨噬细胞呼吸暴发产生的氧化物的杀伤［5］。

    Jun等观察到结核分枝杆菌的eis(enhanced intracellular survival)基因可以增强结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活能力。当eis基因受到损伤后，结核分枝杆菌在巨噬细胞中的细胞内生存能力大大降低，同时发现eis基因只出现于致病性的分枝杆菌或是实验室中产生的工程菌，而不存在于其他为数众多的非致病分枝杆菌［6］。

    2  异柠檬酸裂解酶与结核分枝杆菌在巨噬细胞内持续存活的关系

    乙醛酸支路是除脊椎动物外，在原核生物、低等真核生物和植物中广泛存在的代谢支路，由异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase，ICL)和苹果酸合成酶(malate synthase，MAS)介导［7］。ICL裂解异柠檬酸生成琥珀酸和乙醛酸(图1)，琥珀酸可构建细胞的糖和其他细胞成分，ICL是乙醛酸支路的关键酶［8］。当培养基的碳源受到限制和在乏氧或缺氧的条件下，结核分枝杆菌表达异柠檬酸裂解酶，乙醛酸支路启动［9］。Mckinney的研究表明，ICL对持留结核分枝杆菌在巨噬细胞内的持续存活是至关重要的。敲除异柠檬酸裂解酶编码基因icl的突变体Δicl在感染小鼠0～2周期间的平均倍增时间为50.8h，与野生株(52.6h)相当。但敲除株的持留性和毒力降低，2周后小鼠的肺和肺外组织中Δicl突变体被活化的巨噬细胞完全清除，16周时细菌负荷指数由6.7log下降至5.2log；野生株菌负荷指数在整个实验期间保持不变，仍为6.8log，显示出持留现象。也就是说，在结核分枝杆菌感染小鼠肺部的持留阶段(2～16周)，异柠檬酸裂解酶对结核分枝杆菌的存活起关键作用；但在感染前期(0～2周)ICL不是必需的［8］。

    图1    异柠檬酸裂解酶催化反应3  异柠檬酸裂解酶的基本介绍

    异柠檬酸裂解酶对于结核分枝杆菌在体内的持续感染至关重要，了解异柠檬酸裂解酶的某些基本性质，特别是能影响其活性的重要位点，将有效地推动以异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物的研发。

    3.1  表达条件

    当向最低限度培养基中补充乙酸盐或棕榈酸盐时，结核分枝杆菌表达异柠檬酸裂解酶的水平将显著上调。学者们发现，不论培养基是以什么作为碳源，异柠檬酸裂解酶都可以实现低限度的表达［9］。

    结核分枝杆菌表达ICL的水平与其对氧的利用率有直接关系，在通风条件下培养1～2周所表达的ICL总量比相同培养基相同时间内缺氧培养的结核分枝杆菌表达该酶数量明显减少。Wayne等观察到结核分枝杆菌在适应氧浓度较低条件生存时，其表达的ICL的酶活性有短暂的提升［10］。在宿主细胞内，结核分枝杆菌面对着无游离氧的缺氧环境，其氧呼吸代谢关闭，启动乙醛酸支路获取能量。

    3.2  结构特征

    异柠檬酸裂解酶在细菌(Kornberg，1966)、古生菌(Serrano et al.，1998)、酵母(Taylor et al.，1996)、真菌(Lorenz and Fink，2001)以及高等植物(Eastmond and Graham，2001)中普遍存在。

    在M.tuberculosis中由icl基因编码的异柠檬酸裂解酶是一个由428个氨基酸组成的含有四个亚单位的蛋白［11］，每个亚单位由14个α螺旋和14个β折叠组成(图2、图3)。这一结构最显著的特征是亚单位螺旋之间的相互交换。这种交换在其他酶蛋白中可以保证稳定的二聚体的形成，并有利于产生显著的构象改变以便使其活性环状区域与底物相结合［12］。

    这个蛋白的核心由8个α螺旋(α4～α11)和8条β折叠(β2～β5，β8，β12～β14)前后交错形成圆桶状结构。一个α螺旋(α12)处于8个β折叠的后方， 这个α

    图2    异柠檬酸裂解酶四聚体结构图3    ICL四聚体亚单位结构

    螺旋和另2个α螺旋(α13和α14)与相邻的亚基产生独特的相互作用。5个β折叠(β6，β7，β9，β10，β11)组成一个结构域，处于蛋白核心——圆筒结构的上方，这个结构域包括了许多酶的活性位点区域。例如，一个紧邻残基Glu247的大约包括100～160个氨基酸的序列位于这一结构域，此序列在许多植物表达的ICL中都存在，其功能可能与靶向作用于过氧化物酶体有关［13］。

    上述β-结构域中含有ICL的一个重要催化残基——K189KCGH193，此残基位于一个可变型的环形模体中，可通过构象变化与底物相结合。K189KCGH193中含有亲核性的半胱氨酸(Cys191)，当酶与底物结合后，Cys191与底物相邻，并且与底物竞争结合位点，进而封闭活性区域。

    通过生物信息学的分析我们得知ICL蛋白可以分为两大类，他们以不同的长度和结构域组成而区分。第一类由小的真细菌类ICL蛋白组成，其中就包括结核分枝杆菌产生的异柠檬酸裂解酶。这一类的ICL蛋白含有结构域1、3，结构域1包括了保守的催化模体KKCGH。第二类由中等长度的植物以及真菌ICL蛋白组成，除了结构域1、3还包括第一类ICL蛋白所缺少的结构域2［14，15］。

    3.3  催化机制

    异柠檬酸裂解酶将异柠檬酸的C-C键可逆地裂解，使异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸。异柠檬酸裂解酶的催化机制正是由这一裂解过程的逆反应所揭示的。乙醛酸首先深入ICL的活化位点区域并与之结合，琥珀酸再加入形成三重复合物。这一过程中关键的一个步骤是琥珀酸中α质子的去质子化。K189KCGH193残基中的Cys191在邻近His193的协助下使亲核的α质子从琥珀酸的第二个碳原子上脱离［16］。抑制剂与ICL结合后，这两个位点移动了5?，这直接导致质子无法转移。至于C-C键是如何断裂的，还有待于进一步研究。

    3.4  金属离子、pH对ICL酶活力的影响

    在缺乏二价阳离子的情况下，经过纯化的异柠檬酸裂解酶只有极微弱的活性；然而加入Mg2+或Mn2+后则恢复了酶活。培养环境中含有5mmol/L的Mg2+异柠檬酸裂解酶的活性最大，Mn2+被认为可以代替Mg2+，但其激活能力只为Mg2+的39%。Robertson等在研究大肠埃希菌表达的ICL时也证明Mn2+可以替代部分Mg2+对异柠檬酸裂解酶活性的激活作用［17］，而其他二价阳离子如Co2+、Fe2+、Ca2+、Ba2+、Ni2+、Cd2+、Zn2+、Cu2+和Hg2+则不能明显的激活酶的活性。Glachetti等证明异柠檬酸裂解酶的真正底物不是异柠檬酸，而是Mg2+异柠檬酸复合物［18］，以此说明为何Mg2+对ICL具有激活作用。

    学者混合两种等量的二价金属离子，以测定其对异柠檬酸裂解酶的抑制性。发现Ca2+和Ba2+的混合试剂无法抑制ICL的酶活性；Mn2+与Zn2+混合可以抑制将近25%的酶活；其他阳离子的抑制率无法达到更高的水平。

    ICL的酶活性有pH依赖性。在pH为6.8～7.0的酶反应体系中，异柠檬酸裂解酶的活性最高。pH低于6或高于8时酶活性仅为最大酶活的一半；而当pH高于9，酶活性则完全丧失。

    3.5  结核分枝杆菌中的另一种异柠檬酸裂解酶

    通过对结核分支杆菌(H37Rv)基因组的序列分析人们发现了第二种编码异柠檬酸裂解酶的基因aceA。推测aceA是由于移码突变而形成的开放阅读框(ORF)，其被认为是一个假基因(pseudogene)。这个基因表达的蛋白由766个氨基酸组成，蛋白的分子量约为84.3ku。

    尽管都可以表达异柠檬酸裂解酶，但这两个基因(icl和aceA)的作用并不相当，有证据表明aceA不能补充icl的缺失［8］。生化方面的研究显示AceA的异柠檬酸裂解酶活性明显低于ICL的酶活，AceA只是对ICL的辅助，并不能在乙醛酸支路中发挥作用。但由于AceA与ICL有一些共同的活性区域(如KKCGH)［14］，如果找到对这两个蛋白均有抑制作用的抑制剂，其作用位点则更好确定。

    4  异柠檬酸裂解酶的抑制剂

    衣康酸二甲酯(dimethyl itaonate)、衣康酸酐(itaconic anhydride)、3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate)和3-硝基丙酸盐(3-nitropropionate)都是异柠檬酸裂解酶抑制剂，抑制剂常数(inhibition constant，Ki)分别为120、190、120和3μmol/L。3-溴丙酮酸和3-硝基丙酸盐对生长在含有葡萄糖的培养基中的细菌无任何抑制作用，但可以抑制培养基含有乙酸盐的分枝杆菌。

    大多数抑制剂都可以归结为琥珀酸循环或乙醛酸循环反应产物的结构类似物，有可能是异柠檬酸裂解酶的竞争性抑制剂，与其争夺底物。

    3-硝基丙酸盐是一种公认的ICL抑制剂，通过对一个由乙醛酸、未反应的琥珀酸盐类似物以及3-硝基丙酸盐(3-nitropropionate)组成的蛋白复合体结构的研究，我们可以了解抑制剂3-硝基丙酸盐如何占据蛋白的活性位点。在上述复合体中，为了形成稳定的结构以便结晶化，有催化活性的Cys191突变成为Ser。乙醛酸的结合位点处于活性位点的内部，并与活性位点上的Mg2+离子协同作用。3-硝基丙酸盐则与位于底物结合位点的残基相互作用。抑制剂与酶结合后，酶的活性中心(残基185～196)将移动将近10～15?，使得活性中心封闭。活性中心附近有一残基411～427，其羰基端移到环状活性区域的上方，在空间上占据活性位点使具催化活性的构象无法形成。尽管3-硝基丙酸盐对ICL的抑制作用十分明显，但3-硝基丙酸盐有强烈的神经毒性，其抑制线粒体信号链，造成ATP生成减少并产生大量的自由基。这些自由基如果无法顺利清除造成堆积就会导致中枢神经广泛的神经衰退以及神经细胞死亡［19］。

    3-溴丙酮酸可通过与亲核的Cys191形成共价的络合物从而抑制异柠檬酸裂解酶的活性［14］。近来有学者研究3-溴丙酮酸对于晚期癌细胞的杀伤作用，他们观察到用3-溴丙酮酸处理的大鼠肝癌细胞在30min内停止了制造ATP，并且很快就开始了细胞的自我毁灭过程。3-溴丙酮酸可以通过抑制细胞的糖裂解和氧化磷酸化，阻断细胞的ATP产生，故推测3-溴丙酮酸是一种能量阻断剂［20］。院的化学品安全特性数据库显示，3-溴丙酮酸为一类有毒物质，毒性级别为高毒(www.toxic.csdb.cn)。因此，3-溴丙酮酸不适于作为抗结核药物。

    尽管现在还没有发现可以作为抗结核药物的ICL抑制剂，但是抑制剂复合体的结构研究揭示，对于众多已知的ICL酶底物类似物，可以通过对其结构进行改造，以制造出新型、高效的ICL抑制剂。

    5  异柠檬酸裂解酶可作为研发其它抗菌药物的靶点

    乙醛酸支路是除脊椎动物外，在原核生物和低等真核生物和植物中广泛存在的代谢支路，其中病原微生物可以通过此途径以脂肪酸作为唯一碳源生存。

    与结核分枝杆菌相似，沙门伤寒杆菌(Salmonella enterica serovar typhi)在感染过程中可以启动乙醛酸循环作为能量代谢途径，使其在巨噬细胞内生存，处于持续感染状态［21］。

    白念珠菌(Candida albicans)在感染人体的初期会被巨噬细胞吞噬形成吞噬体。前者通过乙醛酸循环，以脂肪酸作为能量来源，从内部裂解巨噬细胞，在机体扩散。相对于结核分枝杆菌和沙门菌的持续感染，白念珠菌在巨噬细胞内的存在是十分短暂的，但乙醛酸支路仍是影响白念珠菌毒力重要环节［22］。

    异柠檬酸裂解酶作为乙醛酸支路中的关键限速酶，它的缺失将直接阻断乙醛酸循环。实验证明icl基因的缺失可导致白念珠菌和慢性感染状态下沙门菌的毒力减弱［23，24］。其他学者的研究也证实了异柠檬酸裂解酶对于马红球菌(Rhodococcus equi)和黑胫病病原菌(Leptosphaeria maculans)致病性的重要作用［25，26］。因此，异柠檬酸裂解酶可以作为研发其它抗菌药物的靶点。

    以ICL作为药物靶标开发的新药具有以下优点：①哺乳动物体内不存在乙醛酸循环，利用ICL为靶点开发出的新药对人体毒副作用较低；②传统药物主要作用于致病菌生长和繁殖过程中的某个关键酶或基因，但是对生长较缓慢或不生长的病菌效果不明显。乙醛酸循环对病菌侵入人体，在巨噬细胞中缓慢生长和潜伏是必需的，使得以ICL为靶点的药物可以有效的作用于这类病菌，这也是与传统药物最本质的区别；③该类药物主要是能量代谢途径中的一些关键酶的抑制剂。这些特点和优势使异柠檬酸裂解酶抑制剂成为潜在的抗持留结核分枝杆菌药物的研究对象。

    由于我们现在已经对异柠檬酸裂解酶的蛋白结构及其与抑制剂相互作用机制有了一定的了解，所以在今后研发ICL抑制剂的过程中，可以通过化学的方法对已知的抑制剂进行结构改造以降低其对人体的毒副作用。同时，由于已知的一些异柠檬酸裂解酶抑制剂是琥珀酸循环或乙醛酸循环反应产物的结构类似物，我们也可以通过对这些产物的结构加以改造，得到高效、安全的ICl抑制剂。

    另一方面，通过建立以ICL为靶点的ICL抑制剂筛选模型，可以对微生物发酵液和现有化合物进行高通量筛选，得到ICL抑制剂。本试验室正在进行此项研究。

    机药物设计(Computer-aided Drug Design，CADD)兴起于20世纪80年代，目前已成为创新药物研究的核心技术之一［27］。我们可以利用CADD的方法，根据已知的ICL蛋白的三维结构，用理论计算和分子模拟方法建立小分子-蛋白复合物的三维结构，预测小分子与ICl蛋白活性位点的相互作用，并在此基础上设计或筛选与ICL蛋白活性位点互补，抑制蛋白活性的新分子。

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