HPLC法测定valrubicin膀胱滴注液的含量及有关物质
【摘要】 目的 建立合适的高效液相色谱法测定valrubicin膀胱滴注液中valrubicin的含量及有关物质。方法 采用岛津Shim-pack VP-ODS色谱柱；流动相为0.015mol/L磷酸溶液(取磷酸1ml，加水稀释至1000ml)∶乙腈(43∶57)；柱温35℃；检测波长254nm；流速1.5ml/min。结果 主药与杂质和或降解产物良好分离，空白油辅料无干扰。以本法检测样品中所含0.05%～10%范围的有关物质，其线性关系良好；在0.01～1.18mg/ml范围内valrubicin浓度与峰面积呈良好的线性关系，适合于含量测定。有关物质检测的LOD为0.1μg/ml，相当于可检出所有浓度低至0.01%的杂质和或降解产物。有关物质检测结果重复性好；含量测定重复性试验测得valrubicin平均含量为96.8%(RSD=0.34%，n=9)。Valrubicin含量测定的平均回收率为100.5%(RSD=0.4%，n=9)。结论 本法色谱性能明显优于USP个论方法，专属性强，更适用于valrubicin膀胱滴注液的含量测定和有关物质检测。
【关键词】 Valrubicin； 膀胱滴注液； 高效液相色谱法； 含量测定； 有关物质
ABSTRACT Objective To establish an alternative high performance liquid chromatography method for the determination of valrubicin and its related substances in valrubicin intravesical solution. Methods TheHPLC method was applied with a Shimadzu Shim-pack VP-ODS (4.6mm×150mm, 5μm) column by anelution system consisted of 0.015 mol/L phosphate acid solution (phosphate acid 1ml added to 1000ml water)∶acetonitrile (43∶57); the flow rate was 1.5 ml/min. The detective wavelength was set at UV 210nm; the column temperature was hold at 35℃. Results The good resolution between peaks of valrubicin and the adjacent impurity and/or degradation product was achieved. The blank excipient consisted of polyoxyl 35 castor oil and ethanol (50∶50) did not interfere in the separation and detection of valrubicin. The linear range for analysis of the related substances of valrubicin in intravesical solution samples was 0.05%～10%, and the linear range for valrubicin assaying was 0.01～1.18 mg/ml. The LOD of the related substances of valrubicin in simulated samples spiked with the blank excipient was 0.1 μg/ml. The average recovery of the method was 100.5% with RSD of 0.4% (n=9); and the average content 96.8% was obtained from the precision test with RSD of 0.3% (n=9). Conclusion The method showed much higher chromatographic performance and specificity than the USP monographic method. It′s sensitive, precise, accurate and robust for assay and impurity analysis. It′s more suitable for the determination of valrubicin and its related substances in valrubicin intravesical solution.
KEY WORDS Valrubicin; Intravesical solution; HPLC; Content determination; Related substance
Valrubicin(戊柔比星，AD32)是多柔比星(曾译阿霉素)的一个半合成同系物，属水溶性蒽环类抗生素，能迅速穿透细胞膜并在胞浆中积蓄，效果好且毒性小，已被用于治疗浅表性膀胱癌。Valrubicin膀胱滴注液［1］系valrubicin加Polyoxyl 35 Castor Oil［2］和无水乙醇(1∶1)制成的无菌油性溶液，临床上通过膀胱内滴注给药，用于卡介菌治疗无效或复发的膀胱原位癌的治疗，疗效明显且耐受性好，USP28版收载了该品的质量标准［3］。我们对国产试制样品进行质量研究时发现，USP个论方法尚不完善，被测物色谱行为不理想，该法的系统性能与适用性受到质疑；本文在充分论证的基础上，建立了替代的HPLC色谱分析方法，用于该品的有关物质检测与含量测定，取得了满意的试验结果。
1 仪器与试药
Agilent 1100型组合式全自动高效液相色谱仪，包括Agilent G1315B DAD检测器、Agilent G1313A ALS自动进样器及配套的Agilent Chemstation for LC 3D化学工作站(Rev.A.10.02)；分析天平为Sartorius BP 211D型；色谱柱为岛津公司Shim-pack VP-ODS柱(4.6mm×150mm，5μm)。
乙腈为色谱纯；磷酸、盐酸、氢氧化钠、30%浓过氧化氢溶液均为分析纯；水为重蒸水。Valrubicin膀胱滴注液试制样品四批(规格为5ml∶200mg，批号分别为040801、040901、040902和040903)、valrubicin工作对照品(批号为200407，有效含量为98.0%)、valrubicin粗品和中间体(碘代物)均由浙江海正药业股份有限公司提供。
2 方法与结果
2.1 测定方法的确立
(1)USP方法的评价 USP28版收载了valrubicin膀胱滴注液。USP个论方法所订色谱系统为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1mol/L甲酸铵溶液∶乙腈(55∶45)(用甲酸调节pH值至4.0)为流动相；检测波长254nm；流速2.5ml。首先对上述色谱系统的优劣性和适用性进行性能评价。
取valrubicin工作对照品及中间体(碘代物)，加USP个论方法规定的溶解介质甲醇制成每1ml中含中间体为0.1mg、含valrubicin 1mg的加样试验溶液，量取10μl进样测试，以2.0ml/min的流速洗脱，结果valrubicin远至47.9min才出峰，峰起始处逐渐上抬，峰形有明显前伸；中间体及其引入的其他杂质均与valrubicin分离较好，对检测尚无干扰。
为提高分析速度和改善峰形，反复调试上述色谱系统的流动相比例、流速等色谱参数，当流动相比例调至38∶62、流速降至1.3ml/min时，再取上述加样溶液进样测试，结果主峰之前有一杂质峰与主峰的分离不佳，分离度仅为1.3；降低流速至1.0ml/min，分离度勉强达到1.5；重复进样数次，没有改观。
用内容量移液管量取膀胱滴注液适量，加甲醇溶解并稀释制成约含valrubicin 1mg/ml的溶液，取10μl进样测试，按调整后的流动相比例以1.0ml/min的流速进行洗脱，结果valrubicin峰在12.3min处流出，峰起始处以30～40°角逐渐上抬，峰形明显前伸(Fig.1)。此现象势必影响积分结果的准确性。不过该系统尚能检出一定数量的杂质峰，其中在4.9min处检出了最大杂质峰，在30.8min处检出了色谱保留最强、怀疑与热降解有关的未知物峰。
另取在高温40℃环境下放置10d的膀胱滴注液适量，加甲醇溶解并稀释成约含valrubicin 1mg/ml的溶液，取10μl进样测试，按调整后的流动相比例进行试验，结果valrubicin峰形与前述现象一致，并发现2.7、4.9和30.9min处的热降解物峰明显增大。再取经60℃放置10d的样品，同法试验，结果发现2.7、4.9和30.9min处的热降解物峰又有更明显增大。
因valrubicin色谱峰形的非对称前伸现象过于明显且始终无法消除(Fig.1已是USP个论方法优化后所能获得的最佳图谱)，故放弃USP28版个论的色谱分析方法，改用下述替代的HPLC法继续进行研究。
(2)替代的HPLC法
色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.015mol/L磷酸溶液(取磷酸1ml，加水稀释至1000ml)∶乙腈(43∶57)为流动相；柱温35℃；检测波长254nm；流速为1.5ml/min。
取本品进行预试验，结果获得了理想的valrubicin色谱峰，主峰与杂质、辅料的分离效果也十分理想，并同样能检出一个相对保留时间接近于主峰3倍的热降解物峰(Fig.2)，故以上述色谱条件为基础建立膀胱滴注液有关物质检测和含量测定的HPLC法。
有关物质检测方法的建立 取本品5ml，置200ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得供试品溶液；精密量取1ml，置100ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得自身对照溶液。精密量取上述两种溶液各10μl进样测试，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
含量测定方法的建立 在有关物质检测方法的基础上制订了本品的含量测定方法。用内容量移液管精密量取本品适量(约相当于valrubicin 200mg)，
置200ml容量瓶中，用流动相分数次洗涤移液管内壁，洗液并入容量瓶中，加流动相稀释至刻度，再精密量取5ml，置25ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取10μl进样测定；另取valrubicin工作对照品，同法测定。按外标法以峰面积供试品中valrubicin(C34H36F3NO13)的含量。
2.2 方法的验证
(1)溶解介质的比较和选择 曾试验以乙腈为介质制备试验溶液，但发现本品的乙腈溶液呈轻度浑浊，滤膜过滤未见效，故不选用。因USP个论方法规定用甲醇制备试验溶液，故又取甲醇进行试验，结果发现其溶解效果要明显好于乙腈，溶液基本澄清，但仍觉不够清澈透明，滤膜过滤无明显改观。考虑到乙腈、甲醇在反相色谱系统中均属强溶剂，易引发溶剂效应，而valrubicin本身对溶剂效应相当敏感，溶解介质与流动相之间的差异越大，对色谱行为的影响越明显，故决定采用新配的、与上机进柱的流动相完全一致的流动相作为溶解介质制备试验溶液。
(2)专属性试验 以强力破坏试验对本品降解产物的形成和方法的色谱效能进行研究。
取本品置4500Lx照度仪下连续照射10d后取样测试，结果色谱图中强光照射所致降解产物峰的数量有一定增加，但均与主峰良好分离。
取本品在120℃电烘箱中放置数小时后取样测试，结果色谱图中高温破坏所致降解产物峰的数量明显增加，部分降解物峰响应较大(45.7min处降解物峰为最大)，而主峰明显缩小，表明有较大程度降解。各降解产物峰均与主峰完全分离。
取本品加6mol/L盐酸溶液适量进行强酸破坏，用6mol/L氢氧化钠溶液终止、中和后取样测试，结果发现色谱图中有数量明显的降解物峰检出，但大多随溶剂峰较快流出或在溶剂峰附近流出，另在9.83min处检出一相对较大降解物峰。各降解产物峰均与主峰良好分离。
取本品加6mol/L氢氧化钠溶液适量进行强碱破坏，用6mol/L盐酸溶液终止、中和后取样测试，结果发现色谱图中有数量明显的降解物峰检出，但大多随溶剂峰较快流出或在溶剂峰附近流出；主峰响应明显缩小，表明有较大程度降解。各降解产物峰均与主峰良好分离。
取本品加3%过氧化氢溶液进行氧化破坏，室温下适时放置后取样测试，结果色谱图中检出了一定数量的降解产物峰(主峰前后未见检出)，可见氧化作用所致降解物峰与主峰之间具有良好的分离度。
上述各强力破坏试验结果表明所建色谱系统可有效检测各种降解产物，适用于本品的有关物质检测和含量测定。
(3)空白干扰试验 用内容量移液管量取本品的空白全溶剂适量，加流动相溶解并稀释制成空白试验溶液，取10μl进样测试，试验结果表明辅料不干扰本品的有关物质检测和含量测定。
(4)线性关系研究
有关物质检测的线性关系 与USP28版个论方法采用HPLC面积归一化法报告有关物质的量不同，本文采用相对准确、严谨的自身对照外标法定量测算和报告。现对该法的线性关系和线性范围进行研究。
精密称取valrubicin工作对照品约20mg，置100ml容量瓶中，加空白全溶剂0.5ml，加流动相适量振摇使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成已知浓度的标准贮备液；分别精密量取适量，加流动相分次分步稀释制成0.5135、1.0270、2.5676、5.1352、7.7028、10.2704、20.5408、41.0816、51.3520、68.4693及102.704μg/ml的梯度测试溶液(可视作供试品中含0.05%、0.10%、0.26%、0.51%、0.77%、1.03%、2.05%、4.11%、5.14%、6.85%及10.3%的杂质)，分别精密进样10μl，记录色谱图，结果对应的主峰面积分别为7.2、14.0、35.0、69.5、105.1、139.9、281.2、564.2、705.5、939.2及1413.0。对上述两组数据进行回归分析，得线性方程：
A=13.7528C-0.7564 r=0.999998(n=11)
提示供试品中含有关物质为0.05%～10%时，检测方法具有良好的线性关系。
含量测定的线性关系 分别精密称取valrubicin工作对照品适量，各加入处方量的空白全溶剂，用流动相溶解并定量稀释制成含valrubicin 0.01006、0.01972、0.05125、0.10057、0.19718、0.51254、0.80399、1.0057及1.1844mg/ml的梯度测试溶液，分别精密量取10μl进样，对应的valrubicin峰面积分别为142.4、270.4、708.1、1400.1、2669.8、7070.5、11085.2、13889.0和16330.2。对峰面积(A)和浓度(C)两组数据进行回归分析，得线性方程为：
A=13798.7C-5.33287 r=0.999995(n=9)
提示在0.01～1.18mg/ml的范围内进样10μl，供试品溶液的浓度与主峰面积呈良好的线性关系。
(5)灵敏度试验 精密称取valrubicin工作对照品适量，加入配方量的空白全溶剂，涡旋混匀，制成模拟膀胱滴注液样品，用内容量移液管精密量取适量，加流动相逐级稀释制成供检测限测试的一组溶液，分别进样10μl，以信噪比为3来确定为本法的最低检测浓度(LOD)。结果测得valrubicin的LOD为0.1μg/ml，该值相当于可检出所有浓度低至0.01%的杂质或降解产物，表明方法具有相当高的灵敏度。
(6)色谱记录时间的确定 从专属性试验项下各强力破坏样品的色谱图中，可以发现本品杂质或降解产物中的绝大多数先于主峰流出，其色谱保留普遍弱于主成分，主峰之后很少有杂质检出，但对脱离冷处保存的样品或已开启时间较长的样品在主峰保留时间约2.7倍处必有一热降解物峰检出，因此本品有关物质检测的色谱记录时间应规定为至少达到主峰保留时间的3倍。
(7)重复性试验 取冷处保存的样品一批(批号040801)，待平衡至室温后，依法取样进行试验，按自身对照法以峰面积大于0.1%的单个杂质(5个)及总杂质，共测定9份，对有关物质检测方法的重复性进行考察，结果见Tab.1。
试验结果表明本法检测有关物质(主要杂质与总杂质)重复性好。
另取上述已平衡至室温的样品，依法连续取样9份测定其中所含主药valrubicin的含量，对方法的重复性进行考察，结果平均含量为96.8%，RSD为0.34%(n=9)，表明本法具有良好的重复性。
(8)准确性试验 本品组成比较复杂，为考察辅料对含量测定方法准确性的影响，按处方配比制备不含主药的空白样品用于加样回收率测定。
根据本品工艺，分别按标示规格(200mg)的80%、100%及120%的投料比精密称取valrubicin工作对照品适量，并按处方配比加入正常量的空白全溶剂，涡旋混合使溶解、均质，即制成模拟的膀胱滴注液，依法取样测定含量；另取valrubicin工作对照品，同法测定，按外标法计算valrubicin的加样回收率。结果见Tab.2。
平均回收率为100.5%(RSD=0.4%，n=9)，表明本法准确性好。
2.3 样品测定
取样品三批(040901、040902、040903)，照上述制定并经验证的方法进行含量和有关物质测定，结果见Tab.3和Fig.3、Fig.4。杂质峰，并为之制订了相应的限度(1个不得过0.5%，3个不得过0.8%)，还规定了除上述4个特定杂质之外的单个杂质的限度(不得过0.5%)及总杂质的限度(不得过3.5%)。虽然针对性较强，要求较为具体，但实际操作起来有困难，计算也比较繁琐，更突出的问题是利用相对保留时间法定性杂质不甚可靠，同一杂质的相对保留值在不同色谱仪、色谱柱或不同试验日、不同实验室之间容易发生偏离，从而使杂质鉴定出现困难或偏差，故本法在不降低要求的前提下将限度简化为“单个杂质峰面积不得过1.5%，总杂质不得过3.5%”，如此可操作性增强，又能有效控制杂质。
USP28版个论将含量限度制订为按标示量计算，含valrubicin(C34H36F3NO13)应为95.0%～105.0%，考虑到本品主药、剂型及辅料的特性和确定货架寿命周期的产品稳定性变化趋势，制订了更为合理的含量限度90.0%～115.0%。
3 讨论
本品工艺处方与国外上市产品完全一致，所用辅料聚氧乙烯蓖麻油(Polyoxyl 35 Castor Oil)亦系国外进口，国内试制样品与国外产品本质无异，但本文研究后认为，USP个论所订色谱分析方法并不适用于国产样品的质量控制，实际上也是对USP方法的否定。实际工作中发现，这样的例子并不少见，如阿奇霉素的氧化铝柱电化学检测色谱法(柱不常用且柱效较低，检测器维护困难，对试剂等级要求高)，琥乙红霉素的聚合物柱色谱法(条件苛刻，试验难度大，不易成功)，硫酸卷曲霉素的氰基柱色谱法(挑剔，仅某一品牌氰基柱可用)，克拉霉素含量测定色谱法(试验溶液浓度偏低，响应很小)，环丙沙星含量测定色谱法(试验溶液浓度过高，信号过载)，其通用性、耐用性或可操作性均不甚理想。
【】
［1］ Thomson Healthcare. Pharmacist′s Desk Reference(PDR) ［S］. Montvale, NJ, USA, 2005
［2］ The United States Pharmacopeial Convention. The United States Pharmacopeia ［S］. Rockville, USA: 2005 (USP28-NF23):3060
［3］ The United States Pharmacopeial Convention. The United States Pharmacopeia ［S］. Rockville,USA:2005 (USP28-NF23):2011;2012
