紫外分光光度法测定头孢拉定胶囊含量的不确定度评价
【摘要】 目的 对紫外分光光度法测定制剂含量的不确定度进行评定。方法 以头孢拉定胶囊为例，建立紫外分光光度法测定头孢拉定胶囊含量的不确定度模型，对紫外分光光度法测定中的各影响因素进行了考察。结果 量化了各分量的相对标准不确定度，并计算出合成标准不确定度，取κ=2(置信概率95%)得出扩展不确定度。结论 在现有条件下使测定结果受控，并可通过分析各分量的相对标准不确定度的大小来优化实验，使测定结果更加可靠。
【关键词】 头孢拉定； 紫外分光光度法； 不确定度； 方法评价
ABSTRACT Objective To estimate of uncertainty on the content determination of cefradine capsules by ultraviolet spectrophotometry. Method The model for evaluation of the uncertainty was established in measurement of the content of cefradine capsules by ultraviolet spectrophotometry. The factors influenced upon the measurement were analyzed and the uncertainty influence of each component was calculated. Result The combined standard uncertainty was obtained by combining all standard uncertainty, then the expanded uncertainty was calculated by using a coverage factor κ=2 with a confidence level of approximately 95%. Conclusion To make the measurement under control, the more reliable result of the measurement could be obtained when the measure was optimized by magnitude analysis all standard uncertainty.
KEY WORDS Cefradine; Ultraviolet spectrophotometry; Uncertainty; Measurement estimation
紫外分光光度法具有操作简单、适用性广等特点，在药品检验、食品检验等学科中被广泛应用。不确定度是与测量结果相联的参数，表征合理地赋予被测量值的分散性。测量不确定度是测量质量的指标，合理地赋予被测量值的区间，用于判断该测定值的可靠程度［韩永志. 统计学在化学分析测量中的应用(国家标准物质研究中心2002年统计学培训讲义)］。本文以紫外分光光度法测定头孢拉定胶囊含量为例，对该方法的不确定度来源及大小进行分析及评定，并探讨紫外分光光度法在应用过程中应注意的问题。
1 仪器与试药
1.1 仪器
天平(d=0.01mg/0.1mg，可互换)：Mettller XS205；紫外分光光度仪：Agilent8453。
1.2 试药
头孢拉定对照品(药品生物制品检定所，批号130427-200306，含量91.8%)；头孢拉定胶囊(市售，每粒0.25g)；水为高纯水；其他试剂均为分析纯。
2 实验方法与结果
2.1 实验过程
测定供试品中头孢拉定的含量的过程见图1。
2.2 实验数据
图1 紫外分光光度法测定头孢拉定胶囊含量操作流程图
共称取样品10份，依法测定，得含量均值为99.57%，RSD为0.6%；所得标准曲线为：
Asi=a+bCsi=0.0244+0.0195Csi R2=0.9999
2.3 建立测定结果的数学模型
(1)标准曲线 以5组数据(Csi，Asi)计算回归方程，得Asi=a+bCsi，其中：Csi=Ws×Ps×Vs2i(i=5)/(Vs1×Vs2)(μg/ml)
导出方差：
［Uc(Csi)/Csi］2=［Uc(Ws)/Ws］2+［Uc(Ps)/Ps］2
+［Uc(Vs2i(i=5))/Vs2i(i=5)］2+
［Uc(Vs1)/Vs1］2+［Uc(Vs3)/Vs3］2
(2)紫外分光光度法测定头孢拉定胶囊含量的计算公式 P=(Cx测/Cx计)×100%
Cx测：依法测定供试品溶液的吸光度(Axi)，从标准曲线上读出供试品溶液中含头孢拉定的浓度Cx测=(Axi-a)/b(μg/ml)；
Cx计=Wxi×Vx2×W标/(Vx1×Vx3×W平)
W平：平均装量0.2665g/粒
W标：标示量0.25g/粒
故：
P=Cx测×Vx1×Vx3×W平/Wxi/Vx2/W标/10
×106×100%
导出方差：
［Uc(P)/P］2=［Uc(Cx测)/Cx测］2
+［Uc(Vx1)/Vx1］2+［Uc(Vx2)/Vx2］2
+［Uc(Vx3)/Vx3］2+［Uc(W平)/W平］2
+［Uc(Wxi)/Wxi］2
3 不确定度的来源及分析
3.1 不确定度的来源
不确定度来源因果分析见图2。
3.2 不确定度的量化分析
(1)对照品溶液引起的不确定度
①头孢拉定对照品的含量的相对标准不确定度Uc(Ps)/Ps 对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号130427-200306，含量(91.8±0.12)%。该含量的不确定度属B类不确定度，且并未提供其他的信息，一般估计为矩形分布［2］，则标准不确定度Uc(Ps)为：
Uc(Ps)=0.0012/31/2=6.928×10-4
灵敏度：由于使用相同的天平，两次称量灵敏度的影响抵消
图2 紫外分光光度法测定头孢拉定胶囊含量的
不确定来源因果分析图 相对标准不确定度：
Uc(Ps)/Ps=7.547×10-4
②天平称重的相对标准不确定度Uc(Ws)/Ws
天平示值的不确定度 使用的天平(d=0.01mg)由校准证书得到天平的最大允许误差为±0.1mg，属B类不确定度，且并未提供其他的信息，一般估计为矩形分布［1］，则其标准不确定度为0.1/31/2=0.0577mg。
天平称重重复性的不确定度 使用天平对一质量恒定的物体(约15mg)反复称重10次，计算其标准偏差为0.0334mg。
单次称量的标准不确定度 (0.05772+0.03342)1/2=0.0667mg，因称量采用减重法，故Uc(Ws)=(2×0.06672)1/2=0.0943mg。
相对标准不确定度 Uc(Ws)/Ws=0.0943/12.66=7.449×10-3
③玻璃仪器(25ml(Vs1)、50ml(Vs3)量瓶)的相对标准不确定度Uc(Vs1)/Vs1、Uc(Vs3)/Vs3
校准 《常用玻璃量器检定规程》JJG196-1990［2］查得，A等品的25ml容量瓶和50ml容量瓶的允差分别为±0.03ml和±0.05ml，属B类不确定度，且并未提供其他的信息，但在一个有效的生产过程中标定值比极限值出现的可能性更高，则此时按三角分布计算优于矩形分布［1］，则标准不确定度为别为0.03/61/2=0.0122ml和0.05/61/2=0.0204ml。
重复性 同一25ml量瓶用水充至刻度，称重，重复10次，计算其标准偏差为0.0046ml；同法操作，50ml量瓶的标准偏差为0.0053ml。
温度 由制造商提供的信息，该容量瓶在20℃校准，而本实验室温度在(20±8)℃范围内变化并近似为矩形分布，属于B类不确定度，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，则25ml量瓶和50ml量瓶的标准不确定度分别为(25×2.1×10-4×8)/31/2=0.0242ml和(50×2.1×10-4×8)/31/2=0.0485ml。
以上三种分量合成得：
Uc(Vs1)=(0.01222+0.00462+0.02422)1/2=0.0275ml
Uc(Vs3)=(0.02042+0.00532+0.04852)1/2=0.0529ml
相对标准不确定度：
Uc(Vs1)/Vs1=0.0275/25=1.1×10-3
Uc(Vs3)/Vs3=0.0529/50=1.058×10-3
④玻璃仪器(5ml分度吸管)的相对标准不确定度Uc(Vs2i)/Vs2i
校准 《常用玻璃量器检定规程》JJG196-1990［2］查得，A等品的5ml分度吸管的允差为±0.025ml，取1、2、3、4和5ml水的允差分别为：±0.005、±0.010、±0.015、±0.020和±0.025ml，属B类不确定度，且并未提供其他的信息，但在一个有效的生产过程中标定值比极限值出现的可能性更高，则此时按三角分布计算优于矩形分布［1］，则标准不确定度分别为：0.005//61/2=0.0020ml，0.010//61/2=0.0041ml，0.015/61/2=0.0061ml，0.020//61/2=0.0082ml，0.025/61/2=0.0102ml。
重复性 同一5ml分度吸管分别吸取1、2、3、4和5ml水，放入一具塞三角瓶中，称重，各体积分别重复10次，分别计算各体积的标准偏差为0.0015、0.0020、0.0014、0.0016和0.0013ml。
温度 由制造商提供的信息，该分度吸管在20℃校准，而本实验室温度在(20±8)℃范围内变化并近似为矩形分布，属于B类不确定度，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，则其吸取1、2、3、4和5ml水时其标准不确定度分别为：(1×2.1×10-4×8)/31/2=9.699×10-4ml，(2×2.1×10-4×8)/31/2=1.940×10-3ml，(3×2.1×10-4×8)/31/2=2.910×10-3ml，(4×2.1×10-4×8)/31/2=3.880×10-3ml，(5×2.1×10-4×8)/31/2=4.850×10-3ml。
以上三种分量合成得：
Uc(Vs2i(i=1))=(0.00202+0.00152+0.000972)1/2=0.00268ml
Uc(Vs2i(i=2))=(0.00412+0.00202+0.001942)1/2=0.00496ml
Uc(Vs2i(i=3))=(0.00612+0.00142+0.002912)1/2=0.00690ml
Uc(Vs2i(i=4))=(0.00822+0.00162+0.003882)1/2=0.00921ml
Uc(Vs2i(i=5))=(0.01022+0.00132+0.004852)1/2=0.01137ml
相对标准不确定度分别为：
Uc(Vs2i(i=1))/Vs2i(i=1)=0.00268/1=0.00268
Uc(Vs2i(i=2))/Vs2i(i=2)=0.00496/2=0.00248
Uc(Vs2i(i=3))/Vs2i(i=3)=0.00690/3=0.00230
Uc(Vs2i(i=4))/Vs2i(i=4)=0.00921/4=0.00230
Uc(Vs2i(i=5))/Vs2i(i=5)=0.01137/5=0.00227
(2)供试品溶液引起的不确定度
①测定胶囊平均装量的相对标准不确定度Uc(W平)/W平。
天平示值的不确定度 使用的天平(d=0.1mg)，由校准证书得到天平的最大允许误差为±1mg，属B类不确定度，且并未提供其他的信息，一般估计为矩形分布［1］，其标准不确定度为1/31/2=0.577mg。
天平称重重复性的不确定度 使用天平对一质量恒定的物体(约450mg)反复称重10次，其标准偏差为0.0527mg。
单次称量的标准不确定度 (0.5772+0.05272)1/2=0.579mg，因二次称量得结果，故Uc(W平)=(2×0.5792)1/2=0.819mg。
相对标准不确定度 Uc(W平)/W平=0.819/266.5=3.072×10-3。
②天平称重的相对标准不确定度Uc(Wxi)/Wxi 同前项分析，故Uc(Wxi)=(2×0.06672)1/2=0.0943mg。
相对标准不确定度Uc(Wxi)/Wxi=0.0943/13.53=6.970×10-3。
③玻璃仪器(25ml(Vx1)、50ml(Vx3)量瓶)的相对标准不确定度Uc(Vx1)/Vx1、Uc(Vx3)/Vx3 同前项分析，相对标准不确定度Uc(Vx1)/Vx1=1.1×10-3、Uc(Vx3)/Vx3=1.058×10-3。
④玻璃仪器(5ml分度吸管)的相对标准不确定度Uc(Vx2)/Vx2
校准 《常用玻璃量器检定规程》JJG196-1990［2］查得，A等品的5ml分度吸管的允差为±0.025ml，取2.5ml水时的允差为±0.0125，属B类不确定度，且并未提供其他的信息，但在一个有效的生产过程中标定值比极限值出现的可能性更高，则此时按三角分布计算优于矩形分布［1］，则取2.5ml的标准不确定度为0.0125/61/2=0.0051ml。
重复性 同一5ml分度吸管吸取2.5ml水，放入一具塞三角瓶中，称重，重复10次，计算标准偏差为0.0014ml。
温度 由制造商提供的信息，该分度吸管在20℃校准，而本实验室温度在(20±8)℃范围内变化并近似为矩形分布，属于B类不确定度，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，则其标准不确定度为(2.5×2.1×10-4×8)/31/2=2.425×10-3ml。
以上三种分量合成得Uc(Vx2)=(0.00512+0.00142+0.0024252)1/2=0.0058ml。
相对标准不确定度Uc(Vx2)/Vx2=0.0058/2.5=2.32×10-3。
⑤求得供试品溶液浓度的相对标准不确定度Uc(Cx测)/Cx测
以对照品溶液制备标准曲线时对Cx测的不确定度 由于Cx测是由标准曲线上读出的，故Uc(Cx测)/Cx测=Uc(Csi)/Csi。
［Uc(Csi)/Csi］2=［Uc(Ws)/Ws］2+［Uc(Ps)/Ps］2+［Uc(Vs2i)/Vs2i］2+［Uc(Vs1)/Vs1］2+［Uc(Vs3)/Vs3］2
其中各相对标准不确定度已经在对照品溶液引起的不确定度中计算得出，故：
Uc(Csi(i=1))/Csi(i=1)=［(7.449×10-3)2+(7.547×10-4)2+(2.68×10-3)2+(1.1×10-3)2+(1.058×10-3)2］1/2=0.0081
Uc(Csi(i=2))/Csi(i=2)=［(7.449×10-3)2+(7.547×10-4)2+(2.48×10-3)2+(1.1×10-3)2+(1.058×10-3)2］1/2=0.0080
Uc(Csi(i=3))/Csi(i=3)=［(7.449×10-3)2+(7.547×10-4)2+(2.30×10-3)2+(1.1×10-3)2+(1.058×10-3)2］1/2=0.0080
Uc(Csi(i=4))/Csi(i=4)=［(7.449×10-3)2+(7.547×10-4)2+(2.30×10-3)2+(1.1×10-3)2+(1.058×10-3)2］1/2=0.0080
Uc(Csi(i=5))/Csi(i=5)=［(7.449×10-3)2+(7.547×10-4)2+(2.27×10-3)2+(1.1×10-3)2+(1.058×10-3)2］1/2=0.0080
其中Csi(i=1)=9.3μg/ml，Csi(i=2)=18.6μg/ml，Csi(i=3)=27.89μg/ml，Csi(i=4)=37.19μg/ml，Csi(i=5)=46.49μg/ml。
得：
Uc(Csi(i=1))=9.3×0.0081=0.0753μg/ml
Uc(Csi(i=2))=18.6×0.0080=0.1488μg/ml
Uc(Csi(i=3))=27.89×0.0080=0.2231μg/ml
Uc(Csi(i=4))=37.19×0.0080=0.2975μg/ml
Uc(Csi(i=5))=46.49×0.0080=0.3719μg/ml
当由拟合的标准曲线求得Cx测时测量所产生的不确定度 通过对照品溶液拟合出的标准曲线如下：
A=bC+a，其中A：吸收度，C：溶液浓度，b=0.0195，a=0.0244。Cx测平均=25.33μg/ml。
Cx测的标准不确定度=SR/b1 P+1/n+(Cx-C)2 ∑n/j=1(Cj-C)2［1］
其中：SR=∑n/j=1［Aj-(a+Cj)］2/n-2［1］
P=10(对Cx进行10次测量)，n=5(对照品溶液采用五个浓度进行测量)。
SR=0.002931μg/ml
Cx测的标准不确定度=0.083352μg/ml。
以上两种分量合成得：
Uc(Cx测)=(0.07532+0.14882+0.22312+0.29752+
0.37192+0.0833522)1/2=0.5580μg/ml
相对标准不确定度Uc(Cx测)/Cx测=0.5580/25.33=0.0220
(3)使用紫外分光光度计引入的不确定度Uc(仪器)
①紫外分光光度计读数的不确定度 由校准证书得到该仪器的吸光度准确度的相对偏差应在±1%之内，吸光度的读数约为0.53，则实际测量值和读数的最大差值为0.0106，属B类不确定度，且并未提供其他的信息，一般估计为矩形分布［1］，其标准不确定度为0.0106/31/2=6.120×10-3。
②紫外分光光度计读数重复性的不确定度 使用该仪器对同一份供试品溶液的吸光度依法进行测定，重复10次，计算其标准偏差为6.89×10-4。
以上两种种分量合成得Uc(仪器)=(0.006122+0.0006892)1/2=6.157×10-3
(4)供试品溶液测定重复性的不确定度Uc(重复性) 精密称取供试品10份，每份依法测定1次，计算其标准偏差为0.0060，该值即为由测量结果的重复性引入的相对不确定度。测定结果(按标示量计)分别为：0.9907、0.9982、0.9949、0.9911、0.9850、0.9974、1.004、1.005、0.9955、0.9951，平均值：0.9957，其标准偏差为0.0060。
3.3 合成标准不确定度
［Uc(P)/P］2=［Uc(Cx测)/Cx测］2+［Uc(Vx1)/Vx1］2
+［Uc(Vx2)/Vx2］2+［Uc(Vx3)/Vx3］2
+［Uc(W平)/W平］2+［Uc(Wxi)/Wxi］2
=0.02202+(1.1×10-3)2+(2.32×10-3)2
+(1.058×10-3)2+(3.072×10-3)2+(6.970×10-3)2
=5.4973×10-4
Uc(P)=P×(5.4973×10-4)1/2=99.57%×(5.4973×10-4)1/2=2.334%
Uc=［Uc(P)2+Uc(仪器)2+Uc(重复性)2］1/2=［0.023342+0.0061572+0.00602］1/2=0.0249→2.49%
3.4 扩展不确定度
U=k Uc，k取2，95%置信概率，U=2×2.49%=4.98%，头孢拉定胶囊中头孢拉定含量(%)可以表示为：P=(99.6±5.0)%。
3.5 不确定度各分量及分析
不确定度各分量及分析见表1。
4 讨论
根据小分量不确定度不足最大分量不确定度的1/3时，小分量不确定度可以忽略不计的原则［3］，由以表1上的评定结果可以看出，本方法测定结果的不确定度大小主要取决于求得供试品溶液浓度的相对标准不确定度的大小。在本方法中供试品溶液浓度是由标准曲线上读出的，由前述分析已知Uc(Cx测)/Cx测=Uc(Csi)/Csi，故供试品溶液浓度的相对标准不确定度的大小是由多个分量叠加得到的，而单个Uc(Csi)/Csi的大小由前分析可以看出主要取决于对照品称重的相对标准不确定度Uc(Ws)/Ws的大小，而叠加是由于制备标准曲线时多次转移液体Vs2i产生的其大少取决于移液体积的相对标准不确定度Uc(Vs2i)/Vs2i的大小。故在利用本方法测定样品时，在规范实验操作、严格控制实验条件的前提下，为了降低本方法的不确定度值的大小，提高测定结果的可靠性，可以通过以下两个途径：①选择稳定性良好的精密天平，可以通过增大对照品的称样量，降低Uc(Ws)/Ws值的大小；②在制备标准曲线时所用的5ml分度吸管已为A级玻璃仪器，故已不能通过提高仪器的精密度改善结果，但可以通过重新设计实验步骤，尽可能的减少稀释转移的次数，减少Uc(Vs2i)/Vs2i分量的个数，减少叠加对结果的影响，以降低Uc(Cx测)/Cx测值的大小。
【】
［1］ 国家质量技术监督局. 《测量不确定度评定与表示》JJF 1059-1999［S］. 1999：14
［2］ 国家质量技术监督局. 《常用玻璃量器检定规程》JJG 196-1990［S］. 1990：5
［3］ 实验室国家认可委员会. 化学分析中不确定度的评价指南［M］. 北京：中国计量出版社，2002
