由一株放线菌产生的对谷胱苷肽转移酶具有抑制作用的活性化合物的研究

【摘要】  谷胱苷肽-S-转移酶-π(GST-π)的活性在某些类型的癌症患者中有显著的升高并且在癌症细胞对抗癌药物耐药性的形成过程中起着重要的作用。抑制过量表达的GST-π的酶活性将有助于克服肿瘤细胞的耐药性，因此，GST-π被认为是一个潜在的药物作用靶点。利用我所建立的GST-π抑制剂高通量筛选模型，在筛选针对GST-π的新的抗癌药物增敏剂的过程中，发现由一株放线菌550产生的发酵代谢产物对来源于人的GST-π产生明显的抑制活性。经有机溶媒萃取、葡聚糖凝胶LH-20柱层析、HPLC制备等方法，从该菌的发酵液中分离到了一个对GST-π有中等程度抑制活性的化合物550-a，其IC50为21.4μg/ml，经各种理化性质及NMR分析确定该化合物与木黄酮(genistein)同质，该化合物对GST-π的酶抑制活性以前尚未见报道。

【关键词】  谷胱苷肽转移酶； 酶抑制剂； 木黄酮

    ABSTRACT  Glutathione S-transferase-π (GST-π) level usually increased apparently in sufferring from certain kinds of cancers, and it played an important role in the process of drug resistant tumor cells against anti-tumor agents. Inhibition of the overexpressed enzyme activity will contribute to overcome the resistance. Therefore, GST-π has been considered as a potential drug target for the cancer treatment. By using the GST-π high throughput screening system model which was developed in our laboratory, an actinomycete strain No.550 has shown inhibitory activity to GST-π. A compound named No.550-A was isolated from the mycelium, and by solvent extraction by Sephadex LH-20 column chromatography, and HPLC purification, the compound showed moderate activity against GST-π with the IC50 of 21.4μg/ml, by physico-chemical spectral analysis, the structure of the compound was identical with genistein, of which having inhibitory activity against GST-π was firstly reported.

    KEY WORDS  GST;  Enzyme inhibitor;  Genistein

    谷胱苷肽-S-转移酶(glutathione S-transferase，简称GST)为细胞内存在的具有解毒作用的酶蛋白［1］，广泛分布于动、植物内。GST作为一种具有多种生理功能的药物代谢酶参与机体的解毒作用，可解除化学诱变剂、促癌剂等的毒性。GST催化还原型谷胱苷肽(glutathione，简称GSH)与亲药物(X)共价结合成GS-X复合物，再转运出体外而发挥解毒作用。    谷胱苷肽转移酶具有多个亚型［2］，其中GST-π是最重要的一种。研究表明，GST-π的酶活性在多种类型肿瘤的患者体内有异常的升高，其水平与肿瘤的耐药性密切相关［3～5］，高活性的GST-π可使肿瘤细胞对某些化疗药物的耐药性升高，导致化疗失败［2］。探讨GST在肿瘤耐药机制中的作用并以GST-π为靶点寻找特异性的抑制剂，对提高临床化疗的敏感性、克服肿瘤的耐药性将产生重要的意义［6］。

    GST-π的酶活性在多种肿瘤患者体内有明显增高，其水平与肿瘤的耐药性密切相关，两者具有明显的功能关系。我们以GST-π为靶点，建立了一个GST抑制剂的高通量筛选模型，应用此模型对从微生物来源的4800个代谢产物进行了筛选，在筛选过程中发现由一株放线菌550产生的发酵产物对来源于人的GST-π产生明显的抑制活性，本文报道对放线菌550所产生的活性物质的研究结果。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    (1)主要试剂  人源(human placenta)谷胱苷肽-S-转移酶-π、底物1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobenzene，简称CDNB)和还原型谷胱苷肽(GSH)均购自Sigma公司；其余化学试剂均为分析纯或色谱纯试剂。

    (2)主要仪器设备  Victor21420多功能测定仪(美国PE公司)，低温离心浓缩仪(德国Christ公司)。

    (3)菌株550的来源  放线菌550来源我国云南省。

    1.2  方法

    (1)GST-π的酶活性测定［7］  在96孔板的样品测定孔中分别加入2μl的待测样品、45μl 3mmol/L CDNB底物工作液和30μl酶液；对照孔和空白孔分别以2μl DMSO和30μl测活缓冲液代替酶液，其余与样品孔相同。30℃保温15min，各孔加入浓度为2.5mmol/L的GSH底物工作液25μl，使反应体系中CDNB和GSH的终浓度分别为1.8和1.5mmol/L。离心2min并振摇混匀，测定各孔在340nm波长处的吸光度(A1)，30℃保温30min后，再测定各孔在340nm波长处的吸光度(A2)。

    样品对GST酶抑制率的公式为：

    抑制率(%)=(A2-A1)对照孔-(A2-A1)样品孔/(A2-A1)对照孔-(A2-A1)空白孔×100%

    取抑制率大于50%的样品为阳性样品。

    (2)菌株550的培养  于500ml的三角瓶中装入100ml种子培养基(含2.4%淀粉；0.1%葡萄糖；0.3%蛋白胨；0.3%牛肉膏；0.5%酵母粉；0.4% CaCO3，pH7.0)。接种后于28℃培养3d，按10%的接种量将一级种子接种于装有100ml发酵培养基(含4.0%可溶性淀粉；2.0%脱脂大豆粉；0.05% FeSO4·7H2O；0.05% K2HPO4；0.03% KCl，pH6.5)的三角瓶中，于28℃振摇培养14d。

    从培养d5开始从发酵培养瓶中取出5ml样品进行经时变化考察，共培养384h(16d)，每天取样后加入两倍体积乙酸乙酯浸泡4h，3000r/min离心15min，取上清液浓缩至干，稀释成一定体积，测定对GST抑制活性。

    2  结果

    2.1  菌株550发酵过程中产物活性的变化

    菌株550发酵过程中产物活性的变化情况见Fig.1。菌株550的跟踪培养，从d5开始每天取样，测定发酵过程中培养液对GST的抑制率，并用HPLC检测活性化合物的产生量，发现在d14活性化合物产生量大，且活性达到高值，之后，活性未见明显增加，故选择发酵液活性最强的培养时间14d为发酵周期。

    2.2  菌株550发酵液的提取

    550发酵液3400ml，经3000r/min离心15min，分别收集菌体与上清液，菌体用3000ml丙酮提取后，蒸去丙酮，用3000ml乙酸乙酯抽提二次，乙酸乙酯层加无水Na2SO4脱水，浓缩抽干，得到褐色物质1.09g，活性测定显示在20mg/ml的浓度下，该提取物对GST的抑制活性为67%。

    2.3  粗提物的TLC分析

    以氯仿：甲醇(10：1，V/V)为展开剂对粗体物进行TLC展开，分别刮取各个条带，用乙酸乙酯提取，浓缩干燥后测活性，结果见Tab.1。测定结果显示，只有条带3含有活性成分。

    2.4  活性条带3的HPLC分析及活性检测

    在上述TLC分析的确定条带3为活性成分的基础上，通过对条带3的HPLC分析，进一步确定活性峰。HPLC分析条件为：流动相：溶液A：0.05%乙酸∶水，溶液B：100% CH3CN；0～2min：20%～40% B；2～20min：20%～100% B；21～35min：100%B；层析柱：6mm×150mm ODS，检测波长：220nm。条带3的HPLC分析图谱见Fig.2，活性测定结果显示保留时间为16.61min的峰为活性组分。

    Fig.2    The HPLC analysis chart of band 3

    2.5活性组份的柱层析制备

    取1g发酵液提取样品，加少量甲醇溶解后，上葡聚糖LH20(2.5cm×50cm)柱进行分离纯化，用100% MeOH洗脱，通过TLC分析，收集合并目标组分，浓缩抽干后得红褐色固体74mg。

    2.6  活性化合物的HPLC分离纯化

    取活性粗品74mg，用5ml甲醇溶解后进行活性纯化合物的HPLC分离纯化，色谱条件为：色谱柱：Phenomenex 10μm，250mm×20cm；流动相：50%乙腈∶水∶0.05%乙酸，检测波长220nm；得淡黄色粉末状物质550-a 13.4mg，HPLC制备图谱见Fig.3。

    2.7  活性550-a的纯度检验

    取化合物550-a适量，用甲醇制成1mg/ml溶液，

    Fig.3    The HPLC isolation chart of compound 550-aHPLC进行纯度分析(色谱条件为：6mm×150mm ODS柱，流动相：50%乙腈∶水∶0.05%乙酸；检测波长220nm；进样量10μl；)，用归一化法得到化合物550-a的纯度大于99.5%。

    2.8  化合物550-a的结构解析：

    化合物550-a为淡黄色粉末，紫外图谱显示有两个吸收峰［UVλmax(MeOH)：195，259］。根据550-a的LC-MS(ES+)(M+1)(m/z)给出的271.4的分子离子峰，确定其分子量为270。

    550-a的13C-NMR和1H-NMR见Tab.2，其中2位氢1H-NMR δ(1H，s，8.315～8.308)为异黄酮类化合物的典型特征，同时，550-a具有三个特征明显的连羟基的质子峰，因此，初步断定其为含三羟基的异黄酮类化合物，并根据羟基所在位置判断为木黄酮(genistein)，550-a与大豆木黄酮1H-NMR和13C-NMR数据比较见Tab.2，两者数据具有很好的一致性。同时，550-a的红外光谱、质谱数据、理化性质等与大豆木黄酮的相一致的分析结果，进一步支持了其化学结构为木黄酮的结论，因此，最终确定分离得到的化合物550-a为木黄酮(genistein)［8］，其化学结构见Fig.4。

    2.9  化合物550-a对GST的酶抑制活性测定

    化合物550-a对GST酶呈现出剂量依赖的抑制作用，其IC50值为21.4μg/ml，呈现出中等程度的抑制活性。

    3  讨论

    木黄酮主要从大豆中提取，但由于在大豆中含量较低，不易得到，因此在国际市场上价格较昂贵。木黄酮对多种癌症具有良好的抗癌活性，有可能被用做新一代的抗癌药物进行开发，我们经MTT法检测也表明其对不同的癌细胞株具有优于常用抗癌药物顺铂和喜树碱的活性。在筛选GST抑制剂的过程中，我们首次发现了木黄酮对GST-π的中等程度的抑制活性，具有一定的开发成为抗癌药物增敏剂的应用潜力。

    放线菌550从发酵液HPLC图谱分析得知，其木黄酮含量较高，杂质少，便于提取，具有实现产业化生产的巨大潜力。

【】
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