前列腺素E1脂微球制剂对大鼠急性肺损伤的影响
【摘要】 目的: 采用大鼠腹腔注射脂多糖（LPS）复制大鼠急性肺损伤（ALI）模型，评价前列腺素E1脂微球制剂（凯时）对急性肺损伤大鼠的保护作用。方法: 雄性健康Sprague Dawley大鼠60只随机分为3组，A组：生理盐水组；B组：LPS模型组；C组：凯时组。动物以硫喷妥纳腹腔注射麻醉，于实验3h分别测量每只大鼠的肺系数，肺通透指数，肺湿重/肺干重，肺组织中髓过氧化物酶（MPO）含量，丙二荃（MDA）和过氧化物歧化酶（SOD）的含量，血清细胞因子TNF-a、IL-12、IL10的浓度，肺组织中NF-KB蛋白的表达，并进行统计学分析。结果: ① B组与A组比较，肺系数，肺通透指数，肺湿重/肺干重显著增加（P＜0.05）；血浆SOD含量，血清细胞因子IL10显著减少（P＜0.05）；肺组织中髓过氧化物（MPO）活性和丙二荃（MDA）含量，血清细胞因子TNF-a，IL-12显著增加（P＜0.05）。② C组与B组比较，肺系数，肺通透指数，肺湿重/肺干重显著减少（P＜0.05）；肺组织SOD含量，血清细胞因子IL10显著升高（P＜0.05）；肺组织中髓过氧化物（MPO）活性和丙二荃（MDA）含量，血清细胞因子TNF-a，IL-12显著减少（P＜0.05）。③ C组与B组比较，NF-kB P65的表达明显低于A组（P＜0.05）。结论: 前列腺素E1脂微球制剂通过抑制NF-kB的表达，减少中性粒细胞的渗出，对LPS诱导的急性肺损伤大鼠有明显保护作用。
【关键词】 急性肺损伤： 前列腺素E1脂微球制（lipo-PGE1）
急性肺损伤（acute lung injury，ALL）/急性呼吸窘近综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）是ICU常见呼吸衰竭之一［1］。ALI和ARDS具有相同性质的病理生改变，所有的ARDS患者都是ALI，但并非所有的ALI患者都是ARDS，ALI是ARDS的早期阶段［2］。有多种致病因素引起ALI/ARDS，其中感染（尤其是革兰阴性菌感染）为首位。LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，它诱导的ALI/ARDS的主要病理生理学改变是肺组织中大量中性粒细胞浸润和肺血管损伤所致的肺水肿［3］。临床上以急性进行性呼吸困难、严重低氧血症，弥漫性肺浸润，肺顺应性降低为主要特征［3，4］。中最早出现ALI/ARDS是在1967年，Ashbaugh等报道了由12例患者组成的资料［5］。自那以来，ALI/ARDS的治疗主要以呼吸机治疗为主，尚无满意的药物治疗。为探讨新的冶疗药物，本研究采用前列腺素E1脂微球制剂（Lipo-PGE1,凯时）治疗由LPS诱导的大鼠急性肺损伤，以评价其治疗效果，为临床治疗ALI/ARDS提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
髓过氧化物酶（MPO）试剂盒、白蛋白试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒和丙二荃（MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，TNF-a、IL-10、IL-12 ELISA试剂盒由意大利米兰的Calbiochem-Novabiochem公司提供，脂多糖（LPS）购置美国Sigama公司，凯时为北京泰德有限公司生产。
1.2 动物
健康成年雄性Sprague Dawley 大鼠60只，体重180~220g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
1.3 实验动物及分组
将雄性健康Sprague Dawley 大鼠60只随机分为3组，A组(n=20)：生量盐水组；B组(n=20)：LPS模型组；C组(n=20)：凯时治疗组。动物以硫喷妥纳30mg/kg腹腔注射麻醉后，A，B组大鼠尾静脉注射生量盐水0.5ml，C组将lipo-PGE1按10ug/kg溶于0.5ml生理盐水尾静脉注射。1h后A组腹腔注射生理盐水1ml，B，C组将LPS按6mg/kg溶于1ml生理盐腹腔注射。于3h后实验结束。
1.4 测定肺泡灌洗液中白蛋白浓度
实验结束后行经部切开气管置管，通过气管导管注射预冷生理盐水2ml，用注射器轻柔抽提后抽出灌洗液，用溴甲酚氯法测定白蛋白浓度并肺通透指数（PPI）：PPI=BALF蛋白含量/血浆蛋白含量。
1.5 肺组织湿干重比
实验结束后，经胸骨正中行剖胸术，心脏穿刺抽血2~3ml，留血清于-80℃保存备用。同时迅速摘取肺脏，吸干表面血污后观察大体改变，称肺计算肺系数（肺系数=肺重量/体重×100%）。取右肺中叶，滤纸吸干表面水分，称湿重（W），然后将标本置于烤箱中（75℃，24h）烤至恒重，称干重（D），计算湿/干重比值（W/D）。
1.6 细胞因子TNF-a，IL-12，IL-10的测定
取得备用血清，用ELISA法测定细胞因子TNF-a，IL-12，IL-10，操作按试剂说明盒进行。
1.7 肺组织中SOD、MDA和MPO含量测定
将肺组织剪碎匀浆，分别取0.1ml肺组织匀浆液，TBA荧光测定法测量MDA含量，分光光度法测定SOD含量，根据文献报道［6，7］的方法测定肺组织中髓过氧化物酶（MPO）的活性。上述操作均按照试剂说明盒进行。
1.8 肺组织中NF-kB p65的表达
取匀浆肺组织20mg，按文献进行Western blot 实验测定NF-kB蛋白的表达［8］。
1.9 统计学处理
统计学处理采用SPAA10.0统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 肺系数，肺通透指数，肺湿重/肺干重
表1示B、C组肺系数，肺通透指数，肺湿重/肺干重明显高于A组（P＜0.05）。C组肺系数，肺通透指数，肺湿重/肺干重明显低于B组（P＜0.05）。
2.2 肺组织中SOD，MPO，MDA含量
表2示B、C组肺组织中MPO，MDA含量明显高于A组（P＜0.05）。C组肺组织中MPO，MDA含量明显低于B组（P＜0.05）。
表2示B、C组肺组织中SOD活性明显低于A组（P＜0.05）。C组肺组织中SOD含量明显高于B组（P＜0.05）。
2.3 炎症因子与抗炎症因子浓度
表3示B、C组血清中TNF-a，IL-12的浓度明显高于A组，IL-10浓度明显低于A组（P＜0.05）。C组血清中TNF-a，IL-12的浓度明显低于B组，IL-10浓度明显高于B组（P＜0.05）。
2.4 肺组织中NF-kB p65的表达
图1示B、C组的NF-kB p65 表达明显高于A组（P＜0.05），C组NF-kB p65的表达明显低于B组（P＜0.05）。表1 各组肺系数，肺通透指数，肺湿重/肺干重比较表2 各组组织SOD、MPO、MDA水平的改变注：*与A组比较（P＜0.05）; # 与B组比较（P＜0.05）。表3 血清中TNF-a、IL-12、IL-10浓度变化注：* 与A组比较（P＜0.05）; # 与B组比较（P＜0.05）。
3 讨论
ALI/ADRS是由于炎症反应导致肺毛细血管内皮和肺泡上皮损伤、血管通透性增高的监床综合征，其一系列临床、影像学和生的异常表现不能用左房压或肺毛细血管压力升高所解释。病理生理改变以肺顺应性降低，肺内分流增加及通气血流比例失衡为主。临床表现为呼吸急促和呼吸窘迫、顽固性低氧血症，胸部X线显示双肺弥漫性浸润影，后期常并发多器官功能衰竭。过去30年中对ALI/ARDS的发病机理进行了深入研究，应用循证医学手段尤其是大样本随机对照研究评价诊疗效果，使得ALI/ARDS的病死率有所降低，死亡率多在30%~40%之间［9］。
大量基础及临床研究表明，ALI/ARDS发病的关键是致病因素（如内毒、缺血/再灌注、创伤等）激活了机体的单核吞噬细胞系统，导致炎性细胞因子TNF、白细胞介素（IL-1、IL-12）等的释放，后者使中性粒细胞激活，大量释放氧自由基、蛋白水解酶、花生四烯酸类脂质代谢造成机体损伤。但更重要的是这些炎性细胞因子可再激活炎症细胞，以自分泌和旁分沁的方式，释放更多的炎性介质和细胞因子，形成瀑布式级联反应，使机体的损伤信号进一步增大和加强。在这些炎性介质和细胞因子释放的过程中，一些转录因子起着一个调节作用，其中最重要的是转录因NF-KB。NF-kB在启动和调控一系列与炎症反应的炎症因子基因表达方面扮演着一个重要的角色，介导ALI等器官功能损害［10］。1997年Ruetten and Thiemermann 报道抑制NF-kB的激活有益于局部或全身炎症反应［11］。这也激发了人们对如何阻止NF-kB激活的研究。TNF-a、IL-12是NF-kB介导的表达的一种重要的促炎症介质。我们的研究证实：LPS诱导了促炎症细胞因子TNF-a、IL-12的大量增加，抑炎症细胞因子IL-10的减少，同时在肺组织里我们也看到了P65SER536磷酸化大大增加，NF-kB被激活。而凯时能够抑制TNF-a、IL-12的增加，促进IL-10的增加，肺组织里P65SER536磷酸化减少。这些数据证明：LPS通过激活NF-kB使促炎症细胞因子TNF-a、IL-12的大量增加抑炎症细胞因子IL-10的大量减少。而凯时可以逆转这一过程，对其机理有待一步研究。
在引起ALI/ARDS的危险因素中，全身感染为首位，尤其是革兰阴性菌。LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，LPS趋化、激活中性粒细胞在肺间质和肺泡腔内大量聚集、释放炎性细胞因子、氧自由基等，损伤肺泡-毛细血管膜，使之通透性升高，引起ALI/ARDS的发生［12］。我们的研究发现：反映肺部中性粒细胞活性的MPO浓度在B、C组明显高于A组，但C组明显低于B组；反映肺部中性粒细胞性的MPO浓度在B、C组明显高于A组，但C组明显低于B；同时SOD活性在凯时组也大大增加。我们的研究也发现：与LPS组相比，凯时治疗组肺肺系数，肺通透指数，肺湿重/肺干重显著降低。这些数据提示，凯时通过减少中性粒细胞的渗出，减轻肺损伤的发生，发挥肺脏保护作用。凯时减少中性粒细胞的渗出作用可能与NF-kB的激活有关，确切的机制仍需进一步的探讨。
总之，我们的研究结果提示，前列腺素E1脂微球制剂可明显减轻LPS诱导的大鼠肺水肿，抑制TNF-a、IL-12的大量增加，促进IL-10的增加。凯时对急性肺损伤大鼠的保护作用可能是通过抑制NF-kB的活性，减少中性粒细胞的渗出而达到的。
【】
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