当归注射液预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌组织中Survivin的表达

【摘要】  目的：观察当归注射液对缺血再灌注损伤心肌细胞内Survivin表达的变化，探讨当归抗心肌缺血再灌注损伤保护作用的机理。方法:将35只SD大鼠随机分成4组:正常对照组(n=5)，假手术组(n=10)，缺血再灌注组(n=10)，当归组(n=10) ,建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色；观察各组动物心肌细胞内Survivin表达的变化。利用HPIAS-2000图像分析系统测定Survivin在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细胞内Survivin表达低呈阴性；当归治疗组心肌细胞内Survivin表达较低呈阴性。假手术组心肌细胞内Survivin表达也较低呈弱阳性，缺血再灌注损伤组Survivin表达较高呈阳性。图像分析结果显示：正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间Survivin表达的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间Survivin表达的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。结论：当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞有重要的保护作用。

【关键词】  当归注射液； 缺血再灌注； 心肌； Survivin

当归含有阿魏酸、多种磷脂、人体必需氨基酸和微量元素等。目前已证明,当归对心血管系统、血液造血系统、免疫系统、抗氧化和清除自由基等多方面均有肯定的药理作用［1］。目前在研究药物治疗心肌缺血方面还没有任何一种能绝对减少心肌梗死,对抗心肌缺血。当归是活血养血的传统中药,具有清除氧自由基、降低胆固醇、抗血栓形成等作用,临床用于治疗高血压病、缺血性心脏病。目前在研究药物治疗心肌缺血方面还没有任何一种能绝对减少心肌梗死,对抗心肌缺血［2］。当归是活血养血的传统中药,具有清除氧自由基、降低胆固醇、抗血栓形成等作用,临床用于治疗高血压病、缺血性心脏病［3］。本实验观察当归注射液对缺血/ 再灌注过程心肌的保护作用,研究当归注射液抗心肌缺血/ 再灌注损伤的作用机理。旨在指导临床合理应用当归治疗心血管疾病,开辟当归在体外循环手术前和术中应用的新途径。

    Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的一个新成员，它主要表达于发育中的胚胎组织以及人类常见的恶性肿瘤组织，而在人类分化成熟组织中不表达（胸腺除外）［4］。Survivin蛋白表达的特异性［5］，有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。以往的研究表明： Survivin与肿瘤细胞增殖、凋亡、血管生成有关，但是Survivin在心肌缺血/ 再灌注损伤中的抗凋亡机制未见报道。本实验采用免疫组织化学方法观察当归注射液对缺血/再灌注过程心肌的保护作用,研究当归注射液抗心肌缺血/再灌注损伤的作用机理。旨在指导临床合理应用当归治疗心血管疾病,开辟当归在体外循环手术前和术中应用的新途径。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物模型制备及分组  选用健康雄性Wistar大鼠（SPF级）35只,体重250～300g左右。腹腔注射戊巴比妥钠4.5 mg·(100g)-1,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸［ 呼吸频率60 次·min-1 ,潮气量2ml·(100g)-1］,沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/ 开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成4组: 正常对照组（不做任何处理）；假手术组（丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎）；缺血再灌注损伤组(IR)（ 缺血/ 再灌注前静脉注射生理盐水0.8ml / kg，结扎左冠状动脉前降支45min ,再灌注120 min ）；当归注射液预处理组（在结扎前20min，静脉注射当归注射液0.8ml/ kg , 其它处理同缺血/ 再灌注组）。

    1.2  主要试剂

    25%当归注射液为武汉大学中南制药厂提供；即用型兔抗鼠Survivin单克隆抗体，即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸，以上试剂均购于北京中杉生物技术有限公司。

    1.3  方法

    1.3.1  常规HE染色  取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色。

    1.3.2  免疫组织化学S-P法检测Survivin相关抗原  主要步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，Survivin均采用高压抗原修复，正常羊血清处理10 min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10 min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，人乳腺癌作为Survivin的阳性对照组。

    1.4  免疫组织化学结果判断

    Survivin以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对Survivin抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

    1.5  统计学处理

    对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和q 检验，检验水准α为0.05。

    2  结果

    2.1  HE染色

    正常对照组可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核位于细胞中央，细胞界限清晰，结构正常；假手术组可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，但可见部分胞浆溶解，结构基本上正常；缺血再灌注损伤组可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，胞浆溶解呈空泡或网状，细胞界限模糊，可见心肌细胞断裂；当归治疗组可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核呈椭圆形位于中央，细胞结构基本正常。

    2.2  Survivin的表达

    正常对照组：心肌细胞内可见极少量的棕黄色颗粒，Survivin表达极弱或无表达；假手术组：心肌细胞内可见极少量的棕黄色颗粒，Survivin表达极弱；缺血再灌注损伤组：心肌细胞内有较多棕黄色颗粒，Survivin表达强；当归组：心肌细胞内无棕黄色颗粒沉积，Survivin表达极弱或无表达。图像分析结果显示：正常对照组：Survivin表达的平均光密度为  0.539±0.014，假手术组：Survivin表达的平均光密度为0.641±0.025，缺血再灌注损伤组：Survivin表达的平均光密度为2.541±0.218；当归治疗组：Survivin表达的表达的平均光密度为0.563±0.019；正常对照组：Survivin表达的阳性面积率为0.437±0.020，假手术组：Survivin表达的阳性面积率为0.583±0.019，缺血再灌注损伤组：Survivin表达的阳性面积率为2.436±0.033；当归治疗组：Survivin表达的阳性面积率为0.468±0.018。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义(P＜0.05)。经q 检验，正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间Survivin的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间Survivin平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。见表1。表1  当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后各组Survivin表达的平均光密度和阳性面积率 正常对照组、假手术组、当归治疗组与缺血再灌注损伤组比较, P＜0.001;△ 当归治疗组、假手术组与正常对照组比较, P＞0.05。

    3  讨论

    近年来,心血管疾病已成为威胁人类生命的主要原因,而心肌梗死的发病率亦呈上升趋势。众所周知,早期溶栓治疗是心肌梗死较为理想的治疗手段,它可以挽救缺血的心肌细胞,减少梗死面积,改善心脏功能。但溶栓造成的再灌注损伤也愈来愈引起临床医务工作者的关注。长时间心肌缺血可造成组织损伤和细胞死亡,早期的再灌注可挽救缺血组织,但仍能造成细胞继续死亡,这种再灌注给组织带来的负性影响被称为再灌注损伤。动物实验发现,于大鼠短暂缺血30 min后进行观察,未见凋亡细胞数量增多。而再灌注240 min于缺血的左室壁,发现有大量的心肌细胞凋亡出现。证实存在再灌注心肌细胞的损伤,且在短暂缺血后再灌注心肌细胞死亡主要为细胞凋亡［6］。提示心肌细胞凋亡是心肌再灌注损伤的特征之一,可能与再灌注心肌迟发性死亡密切相关。

    在心血管疾病中,经常发生缺血再灌注损伤,其机制可能是多因素的,但主要有三个环节:即能量代谢失常、钙超载和氧自由基生成,其中氧自由基是造成缺血再灌注损伤的直接原因［7］。缺血再灌注过程中,机体可通过多种途经产生氧自由基,氧自由基与生物膜发生一系列反应,可破坏心肌细胞结构、损伤心肌细胞膜, 产生大量的脂质过氧化物。

    当归是传统中药,可对缺血心脏冠脉血管有明显的扩张作用,促进心肌侧枝循环的建立,改善心肌血流分布,减轻因缺血再灌注引起的细胞结构的改变。研究发现, 当归对细胞凋亡有防治作用。在再灌注前给药,可明显减少再灌注引起的细胞凋亡,并证明当归对心肌缺血的保护点在再灌注期,这将当归的研究提高到分子生物学水平［8］。

    目前在研究药物治疗心肌缺血方面还没有任何一种能绝对减少心肌梗死,对抗心肌缺血。当归是活血养血的传统中药,具有清除氧自由基、降低胆固醇、抗血栓形成等作用,临床用于治疗高血压病、缺血性心脏病。本实验观察当归注射液对缺血/ 再灌注过程心肌的保护作用,研究当归注射液抗心肌缺血/ 再灌注损伤的作用机理,旨在指导临床合理应用当归治疗心血管疾病,开辟当归在体外循环手术前和术中应用的新途径。

    抗凋亡基因Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制蛋白（inhibitor of 38apoptosis protein，IAP）家族的一个新成员，其编码的蛋白是目前发现的作用最强的凋亡抑制因子，被称为生存素或生存蛋白。目前发现其生物学效应为：抑制细胞凋亡;调节细胞增殖；诱导血管生成。Survivin在机体内表达受到严格调节，在人的生长发育中，存活素在胚胎组织中表达，而在成人分化成熟组织中表达丧失（胸腺除外）［9］。但在肿瘤组织中却特异性高表达，Tamm等检测在体外培养的美国国立癌症研究院（NCI）抗癌药物筛选计划中使用的60种人类肿瘤细胞株，发现均有Survivin基因蛋白表达，Survivin广泛表达于肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、肾癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤等肿瘤。Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的一个新成员［10］，它主要表达于发育中的胚胎组织以及人类常见的恶性肿瘤组织，而在人类分化成熟组织中不表达（胸腺除外）。其生物学效应为：抑制细胞凋亡；调节细胞增殖；诱导血管生成。Survivin蛋白表达的特异性，有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。目前，虽然大量研究证实Survivin与肿瘤的发生、、血管形成及其多药耐药之间有着重要的联系，但是确切机制还不十分明确。

    本实验数据表明,缺血再灌注损伤模型中Survivin蛋白含量明显增加。当归治疗组中Survivin蛋白含量明显降低，表明当归可下调心肌组织中Survivin蛋白的表达水平,对心肌起了重要的保护作用。同时说明当归可抑制心肌缺血再灌注时内皮细胞合成释放细胞因子等炎症介质,减轻心肌损伤。

    心肌缺血再灌注损伤的机制研究已取得了很大的进展, 随着分子生物学、药学等相关学科实验技术的发展, 人们将会对心肌缺血再灌注损伤的机制有更深刻的认识, 找到更安全、有效的治疗措施及治疗药物。相信在广大医药工作者的不断努力下,将会在祖国中医药宝库中发现对心肌缺血再灌注损伤有更好保护作用的药物。

    本实验结果为临床防止缺血再灌注损伤提供了一个新的思路,其确切临床价值有待于进一步的研究和证实。

【】
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7 Faqing T ,Zhi H ,Liqun Y, et al . Epstein2Barr virus LMP1 initiates cell proliferation and apoptosis inhibition via regulating expression of survivin in nasopharyngeal carcinoma. Exp Oncol ,2005 ,27 (2): 962.

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