新型耐药基因传播元件：ISCR

【摘要】  随着抗生素的广泛使用和滥用，细菌的耐药问题日益严重。转座子和整合子可以解释大多数耐药基因在DNA分子间的移动，但它们不能解释耐药基因移动的实质和耐药基因亚种的增长。本文介绍一类传播耐药基因元件——ISCR，并阐明抗生素耐药基因广泛传播的实质。通过借鉴近几年来国内外研究的成果，概括论述ISCR因子与各类抗生素耐药基因的关系，这对耐药基因传播研究具有一定的指导意义。

【关键词】  插入序列(IS)； 共同区域(CR)； 耐药基因

    ABSTRACT  With the widespread using of antibiotic, the issue of antibiotic resistance become more and more serious gradually. Transposon and integron systems can interpret most of the movement of resistance genes between DNA molecules, but they fail to reveal the spread of a substantial and growing subset of resistance genes. In this paper, a spread element of antibiotic resistance genes: ISCR element is introduced, and the nature of the widespread of antibiotic resistance genes is illuminated. With the research in last few years, the relationship come out between antibiotic resistance genes and ISCR elements. This will play a positive role in the aspect of spread of antibiotic genes.

    KEY WORDS  IS;  CR;  Resistance genes

      细菌对抗生素的耐药性再一次成为临床和研究的热点。新型“超级致病菌”在临床中的不断出现，显示了细菌不断改变耐药形式以适应环境变化的惊人能力［1］。细菌拥有一套功能强大的工具以适应细胞基因遗传信息的改变，这套“基因工具盒”与过去相比，具有更强大的功能［2］。

    半个世纪以来，虽然细菌的变异在抗生素耐药性进化中起着重要的作用，但获得抗生素耐药基因依然占主要地位。随着人类和其它一些重要动(植)物相关的细菌之间获得和传播抗生素耐药基因数据的快速积累，我们认识到耐药基因的水平转移受多重因素的驱使， 耐药基因可通过在细胞间和DNA分子间转移来传播。近期发现，虽然这些系统可以解释耐药基因通过转座子(Tn)或整合子(Int)在质粒间、质粒与染色体间乃至同种或不同种属的革兰阴性菌或革兰阳性菌间迁移扩散［3］，但它不能解释传播的实质和耐药基因变种增长的原因。

    插入序列(insertion sequence，IS)是染色体特殊的组成部分，可从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位置，甚至可在不同的染色体之间跳跃［4］。插入序列属于高度可移动性转座因子(transposable element)，是对基因组一个或多个靶位点具有插入能力的小分子DNA片段(<2.5kb)，并常常可以移动邻近的基因。IS在原核和真核生物界广泛存在，由于它在基因组中的插入可能影响细菌基因的表达和突变，目前已成为细菌分子生物学领域研究的热点之一［5］。近期的许多研究为IS因子的活性提供一些论据，其中包括当出现一些致病菌时，IS因子的大量繁殖及IS因子结合基因进入质粒进行复制的重要作用［6］等。

    多种耐抗生素基因常常与被称为“共同区域”(CRs:common regions)的基因相邻，且在第一类整合子之外但靠近一类整合子的3′保守末端，对这些CRs进行对比分析显示它们彼此相关聚集为一类特殊的插入序列，被认为是IS91?like。IS91和类似的转座因子与插入序列不同，由于它们缺少末端反向重复序列(IRs:inverted repeats)，因此它们转移邻近耐药基因是通过滚环复制的形式进行的。它们转座邻近的DNA序列也与大多数IS因子不同［7］，可以由CR因子的单拷贝介导［8］。CRs是一类通过滚环复制(RCR:rolling?circle replication)转座的IS91?like因子家族的延伸成员，CRs可以解释每一类抗生素转移的实质。

    1  ISCR的特点

    1.1  ISCR是类似IS91的转座因子

    IS91家族共有8个成员，即IS91、IS1294、IS801、ISFn1及其两个亚种、IS92L和IS92R，其中对IS91、IS801和IS1294研究数据较多。IS91及其相关的转座因子IS801和IS1294是不寻常的，它们具有不同于其它普通转座因子的三个特点：①它们缺少许多插入因子中普遍存在的终端反向重复序列［9，10］；②IS91的转座机制不同于大多数转座因子，它们是通过滚环复制对邻近耐药基因进行转座(图1)［8］。由于转座因子初始复制的原因，每个因子编码的单个蛋白是同源转座，同时说明终止复制优先于最终转座重组［7］。

    转座因子的转座是一个前进的系统，oriIS是转座因子的一个终端，且作为复制的起点；terIS是IS91、IS801和IS1294的另一端，是复制的终点。oriIS序列可表示为5′GxTTTTxAAATTCCTATxCAT3′，位于IS91和IS1294中转座基因下游大约300bp处，位于IS801转座基因的下游179bp处。在CR序列下游240～250bp处具有与oriIS序列十分相似的连续序列(5′GCGTTTGAACTTCCTATACxx3′)。在这个基础上，假如CR编码的蛋白质存在可能的同源性，那么CR序列的末端是滚环复制起点的结论就是合理的。因此，CR序列具有与相似位置IS91?like因子的两个主要特点，CRs是IS91?like的转座因子。相应地，为了强调它们作为插入序列的同源性和它们被发现的，我们假设它们是特定的ISCR因子。用来区分CRs的数字被保留下来以便区分不同的ISCRs，因此，CR1对应

    图1    IS1294滚环复制机制ISCR1，CR2对应ISCR2，等［1］。

    IS91、IS801和IS1294都保留着IS91的第三个特点是terIS，位于IS91和IS1294转座酶基因起点的上游大约300bp处，位于IS801转座酶基因起点的上游101bp处［8］。复制终止子序列terIS是一个25或26bp长度的序列，包含一个完整的六核苷酸反向重复序列和四核苷酸终止序列(5′GTTC3′)。ISCR2的terIS因子与IS91基团的terIS因子相似，有一个小的反向重复序列，但与IS91的6bp相比，仅有4bp。ISCRs与IS91及其类似转座因子总的序列同源性大约50%［1］。

    IS91的转座因子家族IS1294已经被详细的研究，研究结果显示，当滚环复制机制错误识别terIS和继续向前复制与terIS相邻的DNA时，IS1294可以移动邻近的序列(图2)。得出IS1294普通转座发生率高达1%～10%。IS1294显示了将耐卡那霉素基因从质粒pUB2380移动到另一个质粒R388上，移动的频率大概10-5～10-6。IS1294之所以不寻常是因为一个单独完整的拷贝可以促进对邻近一端序列的转座，特别是与转座因子3′端相邻的情况，且常常在IS91中出现，而其它插入序列仅能移动插入序列两个拷贝之间的DNA［11］。因此，IS1294给我们一个先例，单拷贝的插入序列可以移动邻近的DNA序列。ISCR与IS1294的滚环复制机制一样，ISCR因子移动染色体基因是通过第一步转座到一个邻近染色体的位置，然后通过第二步移动相邻的序列到一个可结合的质粒上，再通过接合作用进入其它细菌的种属。IS1294和ISCR因子展示了一个强有力的移动系统，在理论上，它能转移任何DNA片段(图2)。与仅能转座基因盒形式的转座子系统相比，ISCR因子的系统功能更强大［8］。

    1.2  ISCR的结构

    ISCRs嵌入到复杂的第一类整合子In6和In7中，具有2154bp长度的序列，包含1个ORF序列，orf513编码功能不确定的513个氨基酸序列产物。共发现了12个ISCR，分别为ISCR1，ISCR2，……，ISCR12，每个ISCR的单个开放阅读框组成具有较高的同源性(图3)［1］。

    这些不明功能基因的表达产物为彼此相连的大约500个氨基酸，且围绕中心250个氨基酸的序列具有17.7%～95.9%的同源性(图4)。但是，CRs的同源性在两个方向延伸到ORFs之外。

    1.3  ISCRs与耐药基因相连［2］

    A：oriIS和terIS?1分别为ISCR1转座的起点和终点。带下划线的核苷酸序列分别为5′～3′端读取，用粗黑体字标记的核

    苷酸序列与IS91、IS1294和IS801的序列相匹配［7］。较大的带有箭头实线代表了转录方向，带有箭头的虚线代表了复

    制的方向和起始位置。灰色盒子代表复杂整合子的3′端；

    B：转座的第一个事件是ISCR1转座与复杂一类整合子的3′端相连或相邻的基因。正常情况下，转座酶将识别未知功能

    的terIS?1序列，但是转座酶误将相似的序列terIS?2识别为terIS?1。在一类复杂整合子的3′端和完整的ISCR1的5′

    端的小片段DNA被平截，terIS?1也被截掉，因此，产生了整合子ISCR1复合物。转座子复合物可能会识别与terIS?1

    不相似的terIS?2或terIS?3作为转座的终点，也可能ISCR1不具有转座的终点，那么，转座子复合物可以通过滚环复

    制转座复杂一类整合子的全部基因

    图2    ISCR1移动一类复杂整合子    ISCRs与许多耐药基因决定子相连(图5)［2］。ISCR1与编码氯霉素耐药基因(catAII)、甲氧苄氨嘧啶(dfrA10，dfrA23，dfrA3b，dfrA19)和氨基糖苷类(armA)相连，也和A类β?内酰胺酶(blaCTX?M?2，blaCTX?M?9，blaCTX?M?20，blaPER?3，blaVEB?3)和C类β?内酰胺酶(blaDHA?1，blaCMY?1，blaCMY?8，blaCMY?10，blaMOX?1)相连。最近发现，与ISCR1相连的qnr基因，降低了对喹诺酮的敏感性［12］。ISCR2与编码耐甲氧苄啶的基因(dfrA18，dfrIX，dfrA20)，耐四环素基因(tetR)，耐氯霉素基因(floR)和耐磺胺类(sulII)相连。ISCR3存在于沙门菌属细菌基因组岛及其变种中，与qac、 dfrA10、 ereB、 yieE和yieF相连；ISCR4与blaSPM?1基因相连；ISCR5与blaOXA?45和ant(4′)IIb相连。ISCR因子与编码超广谱β?内酰胺酶基因， 移动的氨苄C型

    图3    ISCRs核苷酸序列的同源性对比

    图4    ISCRs转座酶中心250个氨基酸序列的同源表(灰色标记为最高和最低同源性)

    图5    ISCR与耐药基因相连(灰色为ISCR因子)

    β?内酰胺酶基因和金属型β?内酰胺酶基因(blaSPM?1)相连，且具有广泛传播这些耐药基因的潜能。

    2  ISCR介导复杂一类整合子结构的形成［1］

    在复杂的一类整合子的3′保守末端处发现ISCR1，这似乎是比较特别的。可能是由于ISCR1被平截，然后易位到多种其它位置的原因。假如ISCR1比其它的ISCR因子和类似IS91转座因子的序列短，但仍然保留有转座起点oriIS和完整的转座酶基因，假设转座终点序列terIS缺失，平截3′保守末端与平截ISCR1的5′端，可能是同一个位置。ISCR1介导一系列的转座事件发生，转座ISCR1和一类整合子中不同长度的耐药基因盒，如catA2、dfrA、qnr和各种blaCMY基因。各种数据已经证明，ISCR1一旦在这些位置，类似于IS91的转座因子就具备了形成自由环状形式的能力。环状因子通过两种方式同源重组到一类整合子的3′保守末端而得到复苏。第一种方式是环状形式的ISCR1连同耐药基因插入到普通的一类整合子的3′保守末端，介导形成复杂的一类整合子，如In6和In7；另一种方式Mammeri等［13］报道的一个特别重组形式，环状形式的ISCR1因子连同耐药基因直接插入到带有一个ISCR1拷贝的整合子3′保守末端，介导形成带有两个拷贝ISCR1因子的复杂的整合子(图6)。

    图中用三个步骤来解释复杂一类整合子的结构。A：ISCR1因子的滚环复制(断开3′保守末端)产生了不同长度的转座媒介。

    这些中间产物转座邻近的耐药基因(如catA或qnr)到另外一个位置；B：第二个滚环复制事件产生了包括catA或qnr的环状

    媒介；C：这些环状媒介重组到另一普通一类整合子的3′保守末端(D和E)，从而产生了复杂的一类整合子G和H，或重组到

    已经包括了一个ISCR1的F上，产生复杂的一类整合子I。图中的滚环复制和重组事件为界中广泛的复杂的一类整合

    子的存在提供了解释

    图6    ISCR1介导的复杂一类整合子结构模型

    3  结论

    ISCRs因子通过不受抑制的RCR转座机制移动邻近的耐药基因，且ISCRs因子仅需要单拷贝就可以移动邻近的DNA序列，因此ISCRs因子将是21世纪强有力的基因捕获系统。

【】
  ［1］ Toleman M A, Bennett P M, Walsh T R. ISCR Elements: Novel Gene?Capturing Systems of the 21st Century? ［J］. Microbiol Mol Biol Rev,2006,70(2):296～316.

［2］ Toleman M A, Bennett P M, Walsh T R. Common regions e.g. orf 513 and antibiotic resistance: IS91?like elements evolving complex class 1 integrons ［J］. J Antimicrob Chemother,2006,58(7):1～6.

［3］ 陆坚，唐英春. 超广谱β?内酰胺酶分子生物学基础的研究进展［J］. 抗生素杂志，2001，26(6)：401～405.

［4］ 张茂俊，张建中. 幽门螺杆菌中国菌株IS605插入靶基因的获得及分析［J］. 中华微生物学和免疫学杂志，2005，25(11)：869～872.(［5］ 张宏梅，石磊，李琳. 第一类整合子整合酶基因intI1的定位分析［J］.中国抗生素杂志，2004，29(5):300～302.

［6］ Siguier P, Filée J, Chandler M. Insertion sequences in prokaryotic genomes ［J］. Curr Opin Microbiol,2006,9(5):526～531.

［7］ Poirel L, Decousser J W, Nordmann P. Insertion sequence ISEcp1B is involved in expression and mobilization of a blaCTX?M β?lactamase gene ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2003,47(9):2938～2945.

［8］ Tavakoli N, Comanducci A, Dodd H M, et al. IS1294, a DNA element that transposes by RC transposition ［J］. Plasmid,2000,44(1):66～84.

［9］ Bernales I, Mendiola M V, de la Cruz F. Intramolecular transposition of insertion sequence IS91 results in second?site simple insertions ［J］. Mol Microbiol,1999,33(2):223～234.

［10］ de la Cruz F, del Pilar Garcillán?Barcia M, Bernales I, et al. Single?stranded DNA intermediates in IS91 rolling?circle transposition ［J］. Mol Microbiol,2001,39(2):494～501.

［11］ Mahillon J, Chandler M. Insertion sequences ［J］. Microbiol Mol Biol Rev,1998,62(3):725～774.

［12］ Li X Z. Quinolone resistance in bacteria: emphasis on plasmid?mediated mechanisms ［J］. Int J Antimicrob Agents,2005,25(6):453～463.

［13］ Mammeri H, Van De Loo M, Poirel L, et al. Emergence of plasmid?mediated quinolone resistance in Escherichia coli in Europe ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2005,49(1):71～76.

　　［14］ Hvarstein L S, Gaustad P, Nes I F, et al. Identification of the streptococcal competence?pheromone receptor ［J］. Mol Microbiol,1996,21(4):863～869.

［15］ Pestova E V, Hvarstein L S, Morrison D A. Regulation of competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae by an auto?induced peptide pheromone and a two?component regulatory system ［J］. Mol Microbiol,1996,21(4):853～862.

［16］ Berka R M, Hahn J, Albano M, et al. Microarray analysis of the Bacillus subtilis K?state: genome?wide expression changes dependent on ComK ［J］. Mol Microbiol,2002,43(5):1331～1345.

［17］ Phillips I, Culebras E, Moreno F, et al. Induction of the SOS response by new 4?quinolones ［J］. J Antimicrob Chemother,1987,20(5):631～638.

［18］ Prudhomme M, Claverys J P. There will be a light: the use of luc transcriptional fusions in living pneumococcal cells ［M］//Hakenbeck R, Chhatwal G S eds In The Molecular Biology of Streptococci. Norwich, UK: Horizon Scientific Press,2006:132～138.

［19］ Levine C, Hiasa H, Marians K. DNA gyrase and topoisomerase IV: biochemical activities, physiological roles during chromosome replication, and drug sensitivities ［J］. Biochim Biophy Acta,1998,1400(1～3):29～43.

［20］ Drlica K, Zhao X. DNA gyrase, topoisomerase IV, and the 4?quinolones ［J］. Microbiol Mol Biol Rev,1997,61(3):377～392.

［21］ Gilmore M S, Haas W. The selective advantage of microbial fratricide ［J］. Proc Natl Acad Sci,2005,102(24):8401～8402.

［22］ Hvarstein L S, Martin B, Johnsborg O, et al. New insights into pneumococcal fratricide: relationship to clumping and identification of a novel immunity factor ［J］. Mol Microbiol,2006,59(4):1297～1307.

［23］ Steinmoen H, Teigen A, Hvarstein L S. Competence?induced cells of Streptococcus pneumoniae lyse competence?deficient cells of the same strain during cocultivation ［J］. J Bacteriol,2003,185(24):7176～7183.

［24］ Guiral S, Mitchell T J, Martin B, et al. Competence?programmed predation of noncompetent cells in the human pathogen Streptococcus pneumoniae: genetic requirements ［J］. Proc Natl Acad Sci,2005,102(24):8710～8715.

［25］ Moscoso M, Claverys J P. Release of DNA into the medium by competent Streptococcus pneumoniae: kinetics, mechanism and stability of the liberated DNA ［J］. Mol Microbiol,2004,54(3):783～794.

［26］ Hamoen L W, Venema G, Kuipers O P. Controlling competence in Bacillus subtilis: shared use of regulators ［J］. Microbiology,2003,149(1):9～17.