OXA?50型碳青霉烯酶基因在铜绿假单胞菌中分布的初步研究
作者：刘梅 杜宝中 曾蔚 程曦 陶传敏 康梅 贾文祥
【摘要】 目的 研究铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制。方法 收集非重复34株铜绿假单胞菌临床株，PCR扩增blaOXA?50基因、测序、在GenBank上比对、提取质粒DNA、对该基因进行PCR扩增。结果 PCR检测出34株铜绿假单胞菌中有15株含OXA?50型基因，其中30株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中有12株阳性，4株敏感菌中亦有3株阳性；随机选取1株阳性菌PCR产物送测序，测序结果在GenBank上进行blast比对，显示有两个突变点；blaOXA?50基因扩增阳性的15株铜绿假单胞菌，提取质粒DNA扩增该基因，结果为阴性。结论 本次实验检测了34株铜绿假单胞菌临床株，OXA?50型基因的检出率为44.10%，其中1株发现有两个位点突变；检测到的blaOXA?50编码基因位于染色体上。
【关键词】 铜绿假单胞菌； OXA?50型基因； 碳青霉烯类抗生素
ABSTRACT Objective To study the distribution of OXA?50 gene in Pseudomonas aeruginosa. Methods A total of 34 isolated clinical strains of Pseudomonas aeruginosa were subjected to PCR analysis with primers specific for blaOXA?50, which was used for comparing the sequence results with corresponding sequences in GeneBank, then plasmid DNA of positive strains for PCR was extracted. Results 15 isolated strains showed positive results for blaOXA?50 detection, 12 strains were identified in carbapenems?resistant Pseudomonas aeruginosas, and 3 strains were detected in carbapenems?sensitive Pseudomonas aeruginosa; the sequencing result of one positive strain showed that there were two mutational sites, and the PCR for plasmid DNA of all positive strains were negative. Conclusions In this experiment, the detection rate of blaOXA?50 was 44.10%, there were two mutational sites in one of positive strains, and all the blaOXA?50 were located in chromosome.
KEY WORDS Pseudomonas aeruginosa; blaOXA?50; Carbapenems
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)属革兰阴性杆菌，可引起菌血症、肺炎、泌尿系感染、烧伤感染和囊性纤维化继发感染等疾病，尤其易感染免疫力低下的患者。由于其耐药株不断产生［1～3］，耐药性不断变化，已成为内获得性感染最严重的条件致病菌之一。碳青霉烯类抗生素是一类广谱、高效的抗生素，除分枝杆菌、细胞壁缺损的细菌及一些极罕见的非发酵菌和气单胞菌外，它几乎对所有致病性细菌都有效，目前国内应用的碳青霉烯类抗生素以亚胺培南、美罗培南为主。然而，随着碳青霉烯类的广泛应用，细菌对其敏感性逐年下降，耐碳青霉烯类抗生素的铜绿假单胞菌也在不断增多。据报道［4～6］，铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率从2001年的5.3%上升到2006年的34.4%。华西医院2005年1月～7月铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药率达54.23%［7］。尽管每篇文献中报道的耐药率不同，但从总体上看铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率有逐年升高的趋势，导致对其耐药机制的研究日趋重要。目前为止，铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类抗生素的机制主要有：外膜孔蛋白的丢失、外排泵系统上调以及水解酶(碳青霉烯酶)的产生。本实验主要研究blaOXA?50编码基因在铜绿假单胞菌中的分布情况。
1 料与方法
1.1 材料
(1)菌株来源和菌种鉴定 2004年1月～2005年3月期间从四川大学华西医院分离的34株非重复铜绿假单胞菌临床株以及1株耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌(作为PCR阴性对照)，所有菌株均来源于痰和创面分泌物标本。细菌鉴定按照全国临床检验操作规程常规操作，全部使用MicroScan WalkAway?40全自动微生物鉴定系统，标准质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853(均为本教研室保存)。
(2)试剂 抗生素粉剂均购自华北制药集团股份有限公司，包括：亚胺培南(imipenem，IMP)、环丙沙星(ciprofloxacin，CPLX)、头孢他啶(ceftazidime，CAZ)、哌拉西林(piperacillin，PIPC)和阿米卡星(amikacin，AMK)；细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京天为时代公司；PCR相关试剂购自广州东盛生物科技有限公司。
1.2 药物敏感实验
采用MicroScan快速接种法，直接挑取菌落充分混匀于生理盐水，倾注于配套Negative ComboPanel Type21鉴定药敏板(NC21测试板)，进行体外药敏测定，实验中每批次的鉴定药敏板均用大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853进行质控。同时采用CLSI/NCCLS推荐的琼脂对倍稀释法进行5种药物各15个浓度的体外药敏测定MIC值，以铜绿假单胞菌ATCC27853进行质控，按照CLSL/NCCLS(2004年)规定判断结果。
1.3 细菌DNA的提取
采用北京天为时代公司的细菌基因组DNA提取试剂盒制备细菌模板DNA，提取的DNA经A260/A280测定符合质量标准，置-20℃冰箱保存待用。
1.4 blaOXA?50基因的PCR扩增和序列分析
blaOXA?50基因扩增引物参照Girlich等［8］的报道，由上海英骏生物技术有限公司合成，上游引物S(5′?AATCCGGCGCTCATCCATC?3′)，下游引物AS(5′?GGTCGGCGACTGAGGCGG?3′)，预期PCR产物大小为869bp片段，涵盖了blaOXA?50基因编码序列。PCR反应采用降落PCR，反应条件：预变性94℃ 5min；变性温度94℃ 1min，退火温度65℃ 1min，延伸温度72℃ 1min，两个循环；变性温度94℃ 1min，退火温度64℃ 1min，延伸温度72℃ 1min，两个循环；以此类推，退火温度每降低一度，进行两个循环，当退火温度降到55℃时，循环数变为10个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果在凝胶成像系统下观察，并拍照保存。随机选取一阳性PCR产物送英骏公司测序。
1.5 细菌质粒DNA的提取及blaOXA?50基因的PCR扩增
将细菌基因组DNA PCR扩增阳性的菌株进行质粒DNA提取，采用北京天为时代公司的质粒小量提取试剂盒；然后用相同的引物以及PCR条件进行扩增，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果在凝胶成像系统下观察，并拍照保存。
2 结果
2.1 药物敏感实验
34株铜绿假单胞菌对IMP、CAZ、CPLX、PIPC和AMK五种抗生素的耐药情况见表1。
2.2 blaOXA?50基因的PCR扩增和序列分析
(1)PCR扩增 以特异引物S和AS扩增包括blaOXA?50基因编码序列在内的DNA片段，结果显示30株耐碳青霉烯类抗生素的铜绿假单胞菌中有12株的PCR产物在750～1000bp处出现一条阳性条带，另外4株敏感菌中有3株出现阳性条带，所有阳性条带在同一水平，而作为阴性对照的耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌无此阳性条带。图1中3、4、6、7、8泳道出现阳性条带，对应的菌株编号为：10557、7646、8591、55137、55328，其中10557、7646、8591为耐亚胺培南的铜绿假单胞菌，55137、55328为敏感菌。表1 全自动系统测定34株菌的耐药情况 (2)测序 随机选取一阳性株(菌株编号为10557)PCR产物送测序，将DNA测序结果以及经Primer5.0翻译后得到的氨基酸序列，在GenBank中进行网上Blast比对，DNA序列与PAO1的blaOXA?50编码基因点(即PA5514基因)［8］同源性为99%(有两个变异点，分别是166bp处C→T和348bp处C→G)；氨基酸序列比对结果显示与PAO1 blaOXA?50基因编码的蛋白质同源性为99%(有两个变异点，分别是第56位R→C以及第116位D→E)。
2.3 质粒DNA blaOXA?50基因的PCR扩增结果
15株铜绿假单胞菌基因组DNA blaOXA?50基因PCR扩增阳性的菌株，质粒DNA的blaOXA?50基因的PCR扩增结果均为阴性(未见目的条带)，可初步确定这15株铜绿假单胞菌的blaOXA?50基因位于染色体上。
3 讨论
铜绿假单胞菌是临床上最常见的条件致病菌之一，广泛分布于环境，极易感染全身免疫力低下的患者(尤其是囊性纤维化和慢性呼吸道疾病患者)，且常检出多重耐药株［9］。以亚胺培南、美罗培南为代表的碳青霉烯类抗生素，对包括超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶稳定，是迄今为止抗菌谱最广、作用最强的一类抗生素。随着该类药物的广泛使用，细菌对其耐药的情况也逐年增多。其耐药机制主要有：①碳青霉烯酶的产生；②药物作用靶点的改变；③主动外排泵的过量表达；④高产AmpC酶伴外膜孔蛋白的丢失。碳青霉烯酶可由细菌染色体编码，也可由质粒编码，一旦染色体编码的耐药基因转移到可传递的质粒上，可与质粒上其它耐药基因组合在一起形成多重耐药，并导致耐药性的传播。碳青霉烯酶按Ambler分类有A、B、D三类，D类主要存在于鲍曼不动杆菌中，OXA?50型酶是唯一一个在铜绿假单胞菌中发现的D类碳青霉烯酶。该酶位于染色体上［10］，它编码的蛋白质是poxB酶(D类)的前体［8］。本实验的阳性株中既有对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌，又有对其敏感的铜绿假单胞菌，初步判定该菌并不是碳青霉烯类耐药的主要原因，由于本次实验中敏感株较少，故不能确定该基因的存在与碳青霉烯类抗生素耐药之间是否有关系，即blaOXA?50是否更容易出现在耐药株中。测序结果显示这次发现的blaoxa?50基因不同于以往［8］，但变异点编码的氨基酸是否影响该酶的活性还不知道；另外，这次测序只是随机选取的阳性PCR产物，只能代表该株菌的blaoxa?50基因有变异，要知道该变异是否具有地域特点，下一步需增加实验菌株数目，且阳性PCR产物均需送测序，然后用统计学方法进行分析才能确定；通过提取blaOXA?50基因PCR阳性的15株铜绿假单胞菌的质粒，再以质粒DNA作为模板扩增该基因，结果均为阴性，初步推断本实验检测的所有blaOXA?50基因均不在质粒上，与国外报道一致［11］，这一点可初步说明该基因在菌株间的传播受到限制；虽然在耐药株及敏感株中均有发现该基因，但并不知道它的表达与是否耐药及敏感之间有关系，是否因仅存在而未表达所致的敏感？以及耐药菌与敏感菌中blaOXA?50基因序列是否相同，这些都有待进一步的研究。
【】
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