耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药相关基因的研究

                     作者：颜英俊 刘华 杨明清 黄文方 

【摘要】  目的 分析我院2005年1～12月临床分离34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗生素耐药相关基因存在状况，为临床抗感染提供依据。方法 应用PCR方法检测13种β?内酰胺类抗菌药物耐药相关基因，分别为blaTEM、blaSHV、blaCARB、blaOXA?10、blaPER、blaVEB、blaGES、blaDHA、blaIMP、blaVIM、blaGIM、blaSPM、oprD2；3种氨基糖苷类修饰酶基因，分别为：aac(6′)?I、aac(6′)?II和ant(2")?I；整合酶基因I(intI1)。结果 耐药相关基因blaTEM、blaCARB、blaDHA、blaIMP、oprD2、aac(6′)?I、aac(6′)?II和ant(2")?I、intI1阳性率分别为：5.9%、32.4%、14.7%、17.6%、97.1%、21.2%、33.3%、48.5%、3.0%；其余耐药基因均未检测到。结论 携带多种耐药相关基因是耐亚胺培南的铜绿假单胞菌对多种抗生素耐药的重要原因之一，膜孔蛋白基因oprD2缺失不是本组铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因。

【关键词】  铜绿假单胞菌； 亚胺培南； β?内酰胺酶类； 氨基糖苷类修饰酶； 整合酶I； 耐药基因

    ABSTRACT  Objective  To investigate 34 strains of the antimicrobial resistance related genes of imipenem?resistant Pseudomonas aeruginosa from patients from Jan to Dec 2005.  Method  Antimicrobial?resistance related genes were detected by PCR method, including blaTEM, blaSHV, blaCARB, blaOXA?10, blaPER, blaVEB, blaGES, blaDHA, blaIMP, blaVIM, blaGIM, blaSPM, oprD2, acc(6′)?I, aac(6′)?II, ant(2")?I and intI1.  Results  The positive rate of antibiotics resistant related genes, named blaTEM, blaCARB, blaDHA, blaIMP, oprD2, acc(6′)?I, aac(6′)?II, ant(2")?I and intI1 were 5.9%, 32.4%, 14.7%, 17.6%, 97.1%, 21.2%, 33.3%, 48.5% and 3.0%, respectively. While blaSHV, blaOXA?10, blaPER, blaVEB, blaGES, blaVIM, blaGIM and blaSPM genes were not detected.  Conclusion  The tested strains which carried multiple resistant genes related to imipenem were one of the main cause of the Pseudomonas aeruginosa resistant to many antibotics, while void of oprD2 gene was not necessaryly the main cause of bacteria resistant to imipenem.

    KEY WORDS  Pseudomonas aeruginosa;  Imipenem;  β?lactamases;  Aminoglycoside modifying enzymes;  Integion I;  Resistant genes

     铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)为条件致病菌，广泛分布于界及健康人的皮肤、肠道和呼吸道。正常情况下不感染人体任何组织，但当机体免疫力降低时、严重创伤或医疗操作后，Pa几乎可以感染人体任何组织。临床表现为局部化脓性炎症和全身性感染，常常危及患者的生命。近年来，由于抗生素泛用和滥用，耐药和多重耐药Pa呈上升趋势。亚胺培南为碳青霉烯类药物，是一种新型的β?内酰胺类抗生素，被认为是目前控制某些革兰阴性菌临床感染性疾病最有效的药物之一，但随着广泛使用和过度使用，Pa耐药性也逐渐增加。本文应用分子生物学方法研究我院Pa对常用抗菌药物耐药相关基因的类型和分布流行特点，为临床治疗提供依据。

    1  材料与方法

    1.1  菌株来源与质控菌株

    34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IMPRPa)来自于2005年1～12月我院住院患者的临床分离标本(包括痰液、尿液、伤口分泌物、脓液和血液等)。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853和大肠埃希菌ATCC25922。

    1.2  菌株鉴定及药敏试验方法

    所有菌株均以BD Phoeni×100全自动微生物分析仪鉴定到种，药敏试验采用BD Phoeni×100配套药敏试验复合板，包括阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、美罗培南、哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、头孢吡肟、四环素和复方磺胺甲口恶唑共16种抗生素，头孢哌酮/舒巴坦采用KB法。药敏标准按2005年版CLSI M100?S15规定执行。

    1.3  主要仪器设备与试剂

    Eppendorf centrifuge 5417R低温离心机，恒温金属浴(杭州大和公司)，MJ Peltier Thermal Cycler(美国MJ Research公司)，Bio?RAD电泳仪，Bio?RAD凝胶成像系统，琼脂糖(Oxoid公司)，100bp DNA Ladder Marker(大连宝生物公司)，6×上样缓冲液(北京天为时代)。

    1.4  模板DNA提取

    采用蛋白酶K消化法。

    1.5  基因扩增

    应用PCR方法共检测17种耐药相关基因，引物序列见Tab.1。氨基糖苷类基因aac(6′)?I、aac(6′)?II、ant(2")?I和整合酶基因intI1热循环参数为：93℃预变性2min→93℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，共35个循环，最后72℃延伸2min。β?内酰胺类耐药相关基因blaDHA和oprD2热循环参数为：93℃预变性3min→93℃30s→55℃30s→72℃60s， 共35个循环， 最后72℃延伸5min。其余基因热循环参数为：93℃预变性3min→93℃ 60s→55℃ 60s→72℃ 60s，共35个循环，最后72℃延伸5min。纯水为阴性对照。耐药基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

    1.6  结果判断

    取10μl扩增产物与2μl6×上样缓冲液混匀，点样于1.5%琼脂糖凝胶，100V电压电泳30min，出现目的条带即为检测基因阳性。

    2  结果

    2.1  IMPRPa的耐药特点

    IMPRPa除对阿米卡星100%敏感，对哌拉西林和哌拉西林/三唑巴坦较敏感，敏感率分别为48.39%和55.84%，对其余β?内酰胺类、氟喹诺酮类、四环素、磺胺类抗生素耐药严重，结果见Tab.2。

    2.2  耐药基因检测结果

    本组试验IMPRPa中，17种耐药相关基因检测结果和部分琼脂糖电泳结果分别见Tab.3和Fig.1～Fig.5。

    3  讨论

    近十多年来，由于广谱头孢菌素及碳青霉烯类药物的广泛应用，细菌耐药率有增长趋势，特别是多重耐药和耐IMP的Pa是临床抗感染治疗的难点之一，备受国内外学者关注。我院2005年1～12月分离的34株IMPRPa除对阿米卡星敏感(敏感率100%)外，哌拉西林和哌拉西林/三唑巴坦对Pa有较强的抗菌活性，敏感率分别为48.39%和54.84%，第三代、第四代头孢菌素及氨曲南、喹诺酮类等抗生素抗菌活性差，敏感率为3%～30%。有29.03%的IMPRPa对美罗培南敏感，提示Pa对亚胺培南和美罗培南的耐药机制不尽相同。34株菌对氯霉素、复方磺胺甲口恶唑和四环素全部耐药，因此应重视和加强细菌耐药监测，合理应用和优先选用低耐药可能性的抗生素，将有助于控制细菌耐药，避免IMPRPa引起感染流行［1］。

    细菌产生β?内酰胺酶是细菌对β?内酰胺类抗生素耐药的最重要机制之一，由于Pa具有比较特殊的细胞壁和细胞膜结构，对许多β?内酰胺类抗生素存在固有耐药，临床多采用羧基及酰胺类青霉素、第三代头孢菌素和碳青霉烯类β?内酰胺类抗生素Pa感染。但随着β?内酰胺类抗生素的过度使用和泛用，耐β?内酰胺类抗生素的Pa不断增加，已成为临床抗感染治疗的棘手问题。近年来，国内外学者已从Pa临床分离株中检测到多种β?内酰胺酶和碳青霉烯酶基因。本组实验菌株携带blaTEM、blaCARB、blaDHA和blaIMP耐药基因的阳性率分别为5.9%、32.4%、14.7%和17.6%，可见携带多种β?内酰胺酶基因是本组细菌对β?内酰胺类抗生素耐药的重要原因之一。

    OprD分为D1和D2，研究发现与亚胺培南耐药有关的为OprD2，铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD2孔道是小分子亚胺培南选择性快速进入菌体的特异性通道，也允许带有阳性基团的各种糖类及碱性氨基酸非特异扩散。OprD2蛋白是目前所知的Pa外膜中唯一有助于抗生素通透的孔道蛋白，具有配体特异性，不仅能形成亚胺培南的特异结合位点，同时发现碱性氨基酸为亚胺培南的竞争性抑制剂。其它β?内酰胺类抗生素均不能通过OprD2通道，所以碳青霉烯类抗生素与其它β?内酰胺类抗生素无交叉耐药性［2］。一般认为OprD2缺失是Pa对IMP耐药的主要机制［3～5］，但国内相关报道差别较大，比如：温州地区报道89.3%(25/28)oprD2基因缺失［3］，江苏无锡报道68.8%(11/16)oprD2基因缺失［6］，湖北襄樊报道100% oprD2基因缺失(35株)［5］，浙江绍兴报道研究的5株IMPRPa均无oprD2基因缺失［7］。本研究oprD2基因缺失占2.9%，提示oprD2基因缺失不是本组IMPRPa耐药的主要原因，但不排除因oprD2基因突变或基因表达下调导致Pa对IMP耐药，后续研究正在进行中。

    氨基糖苷类修饰酶(AMEs)可分为三类［8］：乙酰转移酶，由aac基因家族编码；核酸转移酶，由aph基因家族编码；核苷转移酶，由ant基因家族编码。革兰阴性杆菌以aac(6′)?I、aac(6′)?II、ant(2")?I和ant(3")?I等基因常见。AMEs基因多位于整合子上，传播迅速。本组试验菌株中ant(2")?I携带率较高，为48.5%，其次为aac(6′)?II和aac(6′)?I，携带率为33.3%和21.2%。试验结果提示本组试验菌株编码产生AMEs是对庆大霉素耐药的重要原因之一。34株IMPRPa全部对阿米卡星敏感(敏感率100%)，可能是阿米卡星对Pa产生的氨基糖苷类钝化酶较稳定。

    过去人们对细菌耐药性的研究主要集中在细菌染色体基因突变，后来发现获得性耐药基因才是大多数细菌产生耐药性的原因。1989年Stoke等［9］首次提出了一个与耐药基因水平传播有关的新的可移动基因元件——整合子(integion，Int)。整合子是细菌基因组中的可移动遗传物质，携带位点特异性重组系统组分，可将许多耐药基因盒整合在一起，形成多重耐药。整合子是细菌，尤其是革兰阴性菌多重耐药迅速的主要原因［10］。I类整合子在多药耐药的细菌中是最常见的，现已在许多革兰阴性菌中分离出I类整合子，包括大肠埃希菌、沙门菌、Pa、肺炎克雷伯菌和不动杆菌等［11］。杨维青等［12］研究4株临床分离的Pa携带的I类整合子携带了氨基糖苷类耐药基因、甲氧磺胺嘧啶类耐药基因、β?内酰胺酶基因等常见的耐药基因，并证实整合子位于质粒上，在细菌耐药基因传播中起重要作用。本组试验菌株intI1检出率较低，仅为3.0%，提示Pa产生多重耐药不是通过整合子传播，但应引起重视。

【】
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