主动载药法制备硫酸卷曲霉素脂质体及其质量评价

【摘要】  目的 制备硫酸卷曲霉素脂质体，建立含量和包封率的测定方法，初步考察其体外释放。方法 采用pH梯度法制备硫酸卷曲霉素脂质体，超滤法分离脂质体与游离药物，RP?HPLC测定脂质体的含量和包封率，透析法考察脂质体的体外释放行为。结果 超滤法能很好地将脂质体与游离药物分离，测定硫酸卷曲霉素脂质体的含量为10.27mg/ml，包封率为47.8%，脂质体的体外释放规律符合一级动力学过程。结论 pH梯度法适于制备硫酸卷曲霉素脂质体，超滤法可用于硫酸卷曲霉素脂质体包封率的测定，制备的脂质体具有一定的缓释效果。

【关键词】  硫酸卷曲霉素； 脂质体； pH梯度法； 包封率； 体外释放

    ABSTRACT  Objective  To prepare capreomycin sulfate liposomes to develop a method for determining its drug content and entrapment efficiency and to study the release profile in vitro.  Methods  Capreomycin sulfate was encapsulated into the liposomes using the pH gradient dependent remote loading technique. Free capreomycin sulfate and liposomes were separated by ultrafiltration, RP?HPLC was applied to determine the entrapment efficiency and dialysis was utilized to study the release behavior of drug from liposome in vitro.Results  Free capreomycin sulfate and liposomes was well separated by ultrafiltration. The content and entrapment efficiency of capreomycin sulfate liposomes determined were 10.27mg/ml and 47.8% respectively. The release profile in vitro was subjected to the first order model.  Conclusion  The pH gradient technique is suitable for preparing capreomycin sulfate liposomes which exhibits sustained?release profile in vitro. Ultrafiltration established in this study can be applied in the determination of entrapment efficiency of capreomycin sulfate liposomes.

    KEY WORDS  Capreomycin sulfate;Liposome;pH gradients;Entrapment efficiency;in vitro release

     硫酸卷曲霉素(capreomycin sulfate，CS)是一种对结核分枝杆菌有效的抗生素，结构式如Fig.1。由于其对链霉素、卡那霉素耐药的肺结核患者仍有效，因而在抗结核中具有重要价值，常作为二线抗结核药［1］。目前，CS的临床使用剂型多为肌肉注射和静脉滴注。肌肉注射由于局部硬结、疼痛等不良反应，患者无法耐受，致使用药中断，治疗失败。CS的不良反应主要为耳毒性和肾毒性， 因此有必要利用合理的给药系统，降低其毒副作用，提高临床疗效。

    脂质体作为一种安全有效的药物载体，通过与细胞膜发生融合和作用提高治疗效果。已有多种抗生素药物制成脂质体药物传递系统，取得了较好的疗效［2］。脂质体对水溶性药物包封率不高，采用薄膜分散法制备CS脂质体，包封率仅达13%［3］。本实验进行了主动载药法制备CS脂质体，以期获得较高的包封率。

    1  仪器与试药Fig.1    The structure formula of capreomycin

    岛津高效液相色谱仪(LC?10AT泵，SPD?10A紫外检测器，N2010工作站)，超声波细胞粉碎机(宁波新芝科技研究所)，旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂)，超滤器(50K，PALL Corporation，USA)。

    CS原料药(华北制药华胜有限公司)，CS对照品(药品生物制品检定所)，大豆磷脂S100(上海东尚实业有限公司)，胆固醇(天津市博迪化工有限公司)，Triton X?100(北京化学试剂公司)，甲醇、乙腈(色谱纯，天津康科德科技有限公司)，其余试剂为分析纯。

    2  方法与结果

    2.1  CS脂质体的制备［4］

    (1)空白脂质体的制备  称取处方量的脂质材料，置于圆底烧瓶中，用适量无水乙醇溶解，减压蒸发，得磷脂膜。加入300mmol/L柠檬酸溶液(pH4.0)水化，经探头超声处理后依次通过0.8和0.45μm的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液。

    (2)空白脂质体的载药  吸取上述空白脂质体1ml，加入适量CS溶液，并用Na2HPO4溶液(1mol/L)调节外相pH值至近中性，置37℃水浴中孵化20min，即得CS脂质体。

    2.2  CS含量分析方法的建立    (1)色谱条件  色谱柱：ODS?C18柱(250mm×4.6mm，5μm，Diamonsil)，流动相：0.016mmol/L己烷磺酸钠溶液∶甲醇∶乙腈∶冰乙酸(60∶25∶25∶2)，检测波长254nm，流速1.0ml/min。

    (2)标准曲线绘制  精密称取CS原料药适量，用流动相溶解配成浓度约为0.16mg/ml储备液，精密移取一定量的储备液，用流动相配成浓度为16、32、64、96和112μg/ml的溶液，进样20μl记录色谱图。以峰面积A为纵坐标，以浓度C(μg/ml)为横坐标，得回归方程：

    A=32683C-61550  r=0.9998

    表明在16～112μg/ml范围内CS浓度与峰面积呈良好的线性关系。

    (3)专属性实验  精密量取空白脂质体和含药脂质体2ml，用适量5% triton X?100的乙醇溶液破坏后，用流动相稀释至适当浓度，分别进样20μl，记录色谱图(Fig.2)。

    精密移取一定量的储备液，用流动相配成适当浓度的CS溶液，进样20μl，记录色谱图，为CS对照品色谱图(Fig.2)。

    (4)精密度实验  分别取高、中、低3个浓度的CS溶液，同一天内重复测定5次，日内精密度，RSD分别为1.06%、0.96%和0.89%；连续测定5d，计算日间精密度，RSD分别为1.15%、1.06%和0.97%。

    (5)回收率实验  精密量取1ml空白脂质体混悬液，分别加入至1.0、4.0和6.0ml CS储备液(0.16mg/ml)中，用适量5% Triton X?100的乙醇溶液破坏后，用流动相定容至10ml，分别进样20μl，记录峰面积，计算回收率，分别为101.3%、98.2%和98.6%。

    2.3  CS脂质体总药量的测定

    精密量取脂质体2ml，用5% Triton X?100的乙醇溶液破坏后，取适量上述溶液于10ml容量瓶中，加

    1: Capreomycin sulfate I;  2: Capreomycin sulfate II

    Fig.2    The chromatograms of blank liposomes (A), reference solution (B) and CS liposomes (C)流动相溶解并稀释至刻度，进样20μl，测定峰面积；另取CS原料药适量，流动相溶解并稀释成10mg/ml溶液，按“标准曲线绘制”项下方法测定，用外标法供试品中CS的含量。测得三批样品含量分别为10.4、10.6和9.8mg/ml。

    2.4  超滤法测定CS脂质体的包封率

    方法回收率的考察  精密配制高、中、低3个浓度(相当于CS浓度为112、64和16μg/ml)的药物溶液，分别取适量至超滤器中进行超滤，弃去初滤液，收集续滤液，用高效液相色谱法测定药物含量(W)，测定超滤前溶液中药物的含量(W0)。用公式W/W0×100%计算回收率，分别为96.9%、98.1%和102.3%。

    精密量取CS储备液适量，加至空白脂质体中，使CS浓度分别为112、64和16μg/ml，分别取该溶液适量至超滤器中进行超滤，弃去初滤液，收集续滤液，用高效液相色谱法测定药物含量，计算加样回收率，分别为97.2%、97.9%和98.7%。

    包封率的测定  将适量的CS脂质体置于超滤杯中，密封后氮气加压，弃去初滤液，收集续滤液。以流动相稀释定容后进样，计算游离药物含量(W)；精密量取CS脂质体1ml，用适量5% Triton X?100的乙醇溶液破坏后，用流动相稀释定容至适当浓度进样分析，计算脂质体中药物总含量(W0)，包封率的计算公式为：W/W0×100%。测得三批样品的包封率分别为47.6%、46.9%和48.9%(n=3)。

    2.5  CS脂质体的体外释放行为

    精密移取载药脂质体2ml，置于透析袋内，扎牢两端，置于溶出仪小蓝中。释放条件：pH7.4的PBS 150ml，37℃，50r/min。定时取样5ml，同时补充相同体积的介质。高效液相法测定，以外标法计算累积释放量，同时取药物PBS溶液剂2ml于透析袋内作为对比(Fig.3)。由Fig.3可见，脂质体中药物的释放有明显的缓释效果。分别通过零级动力学、一级动力学、Higuchi方程对体外释放曲线进行拟合(Tab.1)，结果显示药物的释放符合一级动力学方程。

    3  讨论

    硫酸卷曲霉素为水溶性药物，为了得到较高的包封率，本实验采用pH梯度法。根据Henderson?Hasselbalch理论，每个pH单位的变化会产生分子型与离子型药物浓度10倍之差。如果脂质体内外pH梯度为3.0个单位时，理论上就会造成药物分子型与离子型浓度的1000倍之差。由于分子型药物易与脂质体双分子膜结合，加之在高于膜相变温度孵化时，脂质体由“胶晶”态变为“液晶”态，膜的通透性大为增加，从而加快了药物分子的跨膜内转过程,提高了水溶性药物的包封率。因此，内外水相pH值，孵化温度和时间都是影响脂质体包封率的重要因素。孵化温度一般要高于相变温度，膜的通透性增加，加快了药物分子的跨膜内转过程，孵化时间不得太长，否则会导致药物分子泄露，反而降低了包封率。

    脂质体包封率的测定方法主要有：透析法、葡聚糖凝胶过滤法、超速离心法和超滤法。透析法时间较长，并且过程中会导致包封在脂质体中的药物泄露，因此所测得包封率偏低；葡聚糖凝胶过滤法预处理较为繁琐，并且可能由于对乳光判断不准确使测得的包封率有误差；超速离心法操作费时且能源消耗较大；而超滤法简便快速，适合测定水溶性药物的包封率。脂质体在体外释放过程中表现出两个释放相。0～0.5h内表现为快速释放相，大约释放总药量的40%左右。这可能是未包封入脂质体的游离药物的释放，测得脂质体的包封率约为47%证明存在40%的游离药物。而0.5～12h则表现为药物的缓慢释放，这是因为脂质体内相的药物要跨越脂质双层才能进入释放介质，脂质体对内相药物的释放起到了缓释作用。

    本实验制备的硫酸卷曲霉素脂质体的包封率可达到47%，远没有达到药典(2005版)附录对脂质体包封率的要求，如何进一步提高其包封率，仍有待研究。

【】
  ［1］ 崔春英，杨淑先，赵长生，等. 静脉注射用硫酸卷曲霉素长期稳定性试验研究［J］. 中国药品标准，2003，4(3)：50～51.

［2］ Oh Y K, Nix D E, Straubinger R M. Formulation and efficacy of liposome encapsulated antibiotics for therapy of intracellular ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1995,39(9):2104～2111.

［3］ Giovagnoli S, Blasi P, Vescovi C, et al. Unilamellar vesicles as potential capreomycin sulfate carriers: Preparation and physicochemical characterization ［J］. AAPS Pharm Sci Tech,2003,4(4):1～12.