顺序注射分光光度法测定左氧氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星

【摘要】  本文基于左氧氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星分别与Fe(III)作用形成黄色络合物的现象，建立了简单、快速测定药物中左氧氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星的顺序注射分光光度新方法。讨论了物理因素和化学因素对方法灵敏度的影响。测定左氧氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星的工作曲线的线性范围均为10～250μg/ml。采用摩尔比法和连续变换法测定络合物的组成，Fe(III)与药物的组成比为1∶2。将方法用于药物中左氧氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星的测定，并与方法进行了对照。

【关键词】  顺序注射分析技术； 分光光度法； 左氧氟沙星； 氧氟沙星； 洛美沙星

    ABSTRACT  A simple and rapid sequential injection spectrophotometric method for the determination of levofloxacin, ofloxacin and lomefloxacin in pharmaceutical preparation was described, based on the complexation reaction between the drug and Fe(III) in sulfuric acid solution. The various chemical and physical conditions that affected the reaction were studied. The calibration graphs were linear in the range of 10～250 μg/ml for levofloxacin, ofloxacin and lomefloxacin. The composition of the complexes was found 1∶2 Fe (III): drug by molar ratio method and Job′s method of continuous variation. The method was successfully applied to the determination of levofloxacin, ofloxacin and lomefloxacin in pharmaceutical commercial formulations. The results obtained were compared with those of the reference methods.

    KEY WORDS  Sequential injection analysis;  Spectrophotometry;  Levofloxacin;  Ofloxacin;  Lomefloxacin

    左氧氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星是三个重要的合成的氟喹诺酮类衍生物，其中左氧氟沙星是氧氟沙星的S?(-)异构体，抗菌作用是氧氟沙星的2倍，是R?(-)?氧氟沙星的8～128倍。上述药物一方面可以抑制革兰阴性菌和革兰阳性菌DNA的旋转，另一方面可以消灭分枝杆菌、支原体和发疹伤寒等的病原体而被广泛应用。已经报道有各种方法用于测定药物、体液和组织中这些药物的含量，其中包括萃取［1～3］和非萃取［4］分光光度法、高效液相色谱法［5～8］、荧光分析法［9～11］、电化学分析法［12～14］、流动注射?化学发光法［15～18］和毛细管电泳分析法［19，20］等。上述方法通常会消耗相对多的试剂，并产生大量废液。

    顺序注射分析是20世纪90年代产生的新分析技术，属于第二代流动注射分析。顺序注射分析具有简便、节省样品和试剂、宜于进行自动化过程检测等特点。在进行药物分析时，不仅要考虑方法的灵敏度、重现性，而且由于要分析大量的样品，必须考虑分析人员的劳动强度，因此，顺序注射技术在药物分析中的应用越来越多［21］。本文的目的是建立一种简单、自动化的方法用于分析药物中上述组分的含量。根据所研究的药物可以分别与Fe(III)生成黄色络合物，运用顺序注射分析技术结合分光光度检测建立了测定左氧氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星的新方法。

    1  实验部分

    1.1  仪器与试剂

    FIAlab 3500顺序注射分光光度计(美国FIAlab仪器公司)；2.5ml注射泵，8通道选择阀。储存管为200cm×0.5mm，反应管为50cm×0.5mm，其它聚四氟乙烯管均为0.5mm内径。系统由机控制，采用FIAlab软件(FIAlab 5.0 E)进行数据采集和处理。USB2000?UV?VIS分光光度计(美国海洋光纤公司)，10mm长的光纤SMAZ型流通池。

    称取1.2055g NH4Fe(SO4)2·12H2O置于0.2ml浓硫酸中加适量水，加热溶解，定容于100ml容量瓶中，即得到0.025mol/L Fe(III)的0.036mol/L的硫酸溶液。取此溶液2.0ml于5.0ml 0.036mol/L的硫酸中，稀释至10ml作为工作液。准确称取适量左氧氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星对照品(药品生物制品检定所)，分别用3%乙醇溶解并定容于100ml容量瓶中，配制成500μg/ml的标准液。

    1.2  实验步骤

    采用顺序注射测定左氧氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星的步骤见Fig.1。以50μl/s吸取1700μl水作载流，再以50μl/s分别吸取50μl Fe(III)溶液和200μl标准溶液或样品溶液，以20μl/s推动1000μl样品塞到达检测器，再以30μl/s推出剩余载流清洗流路。在437nm处测定体系的吸光度。

    2  结果与讨论

    当Fe(III)溶液分别与左氧氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星溶液共存时，溶液立即显示黄色，说明Fe(III)和药物形成了新的络合物。扫描溶液的紫外可见吸收光谱发现，三种络合物的最大吸收波长均位于紫外区，并延伸到可见区， 其中Fe(III)?洛美沙星络合物在437nm有一个肩峰存在； Fe(III)?左氧氟沙星和

    Fig.1    Schematic diagram of sequential injection systemFe(III)?氧氟沙星络合物没有明显的肩峰存在。考虑到三种药物分别在络合物的最大吸收波长处存在吸收，产生干扰，本文均在437nm测量体系的吸光度。

    2.1  反应管和储存管的影响

    考察了内径分别为0.5和0.7mm的储存管对体系灵敏度的影响，结果表明，0.5mm内径的储存管具有更高的灵敏度，故选用200cm×0.5mm的储存管。与内径为0.7mm的反应管相比，内径为0.5mm的反应管灵敏度更高，因此本实验选用0.5mm的反应管。在24～90cm范围内研究了反应管长度对体系灵敏度的影响。反应管长度在40～70cm内，灵敏度最高且吸光度保持不变，本实验选用50cm的反应管。

    2.2  流速的影响

    在15～60μl/s范围内考察了流速对体系灵敏度的影响。实验发现，流速慢时反应灵敏度较高。本实验采用流速为20μl/s。

    2.3  试剂体积的影响和样品体积的影响

    在15～95μl内考察了Fe(III)溶液体积对体系灵敏度的影响，当Fe(III)溶液的体积大于40μl时，体系吸光度达到最大并保持恒定，实验选用吸入50μl Fe(III)溶液。样品体积对检测灵敏度也有影响。随着样品体积的增加，形成了更多络和物，体系吸光度增大。当样品体积大于190μl时，吸光度变化缓慢，故本实验选用200μl的样品溶液。

    2.4  Fe(III)和硫酸浓度的影响

    考察了Fe(III)溶液浓度的影响。随着Fe(III)溶液浓度的增加，反应的灵敏度也随之增大。当Fe(III)溶液浓度大于2.5×10-3mol/L时，吸光度变化缓慢。实验选用Fe(III)溶液浓度为5.0×10-3mol/L。在0.75×10-2～3.25×10-2mol/L内考察了硫酸浓度对体系的影响。硫酸浓度对体系灵敏度几乎没有影响，实验选用2.52×10-2mol/L硫酸溶液。

    2.5  工作曲线和方法的灵敏度及精密度

    在最佳实验条件下，分别绘制了洛美沙星、左氧氟沙星和氧氟沙星的工作曲线。结果表明，上述三种药物均在10～250μg/ml范围内遵守朗伯?比尔定律，其线性回归方程和回归系数分别为：

    A洛美沙星=0.020+0.00592Cr=0.9993(n=5)

    A左氧氟沙星=0.0409+0.00548Cr=0.9996(n=5)

    A氧氟沙星=0.0368+0.00546Cr=0.9996(n=5)

    检测限分别为1.28、1.38和1.39μg/ml。11次平行测定100μg/ml的洛美沙星、左氧氟沙星和氧氟沙星的相对标准偏差分别为1.33%、1.63%和1.07%。完成一次循环分析测定需要140s，因此，方法的进样频率为26/h。

    2.6  络合物组成的测定

    应用摩尔比法和连续变换法分别测定了药物和Fe(III)的络合物的组成比，结果表明，药物与Fe(III)的组成比均为2∶1。

    3  应用

    分别取10片含有上述组分的药片，研磨后，准确称取相当于主成分50mg，用3%乙醇定容于100ml容量瓶中。过滤，取适量中段滤液，定容于10ml容量瓶中，按实验方法进行测定。取适量注射液，用3%乙醇定容于50ml容量瓶中，取适量该溶液用水定容于10ml容量瓶中直接测定，同时进行回收率实验，并将测定结果与方法对照，结果见Tab.1。由Tab.1可见，该方法的分析结果令人满意。

【参考】
  ［1］ Ragab G H, Amin A S. Atomic absorption spectroscopic, conductometric and colorimetric methods for determination of fluoroquinolone antibiotics using ammonium reineckate ion?pair complex formation ［J］. Spectrochim Acta A,2004,60(4):973～978.

［2］ Issa Y M, AbdelGawad F M, AbouTable M A, et al. Spectrophotometric determination of ofloxacin and lomefloxacin hydrochloride with some sulphonphthalein dyes ［J］. Anal Lett,1997,30(11):2071～2084.

［3］ Sastry C S P, Rao K R, Prasad D S. Extractive spectrophotometric determination of some fluoroquinolne derivatives in pure and dosage forms ［J］. Talanta,1995,42(3):311～316.

［4］ Kapetanovic V, Milovanovic L, Erceg M. Spectrophotometric and polarographic investigation of the ofloxacin?Cu(II) complexes ［J］. Talanta,1996,43(12):2123～2130.

［5］ Cheng F C, Tsai T R, Chen Y F, et al. Pharmacokinetic study of levofloxacin in rat blood and bile by microdialysis and high?performance liquid chromatography ［J］. J Chromatogr A,2002,961(1):131～136.

［6］ Foster R T, Carr R A, Pasutto F M, et al. Stereospecific high?performance assay of lomefloxacin in human plasma ［J］. J Pharm Biomed Anal,1995,13(10):1243～1248.

［7］ Samanidou V F, Demetriou C E, Papadoyannis I N. Direct determination of four fluoroquinolones, enoxacin, norfloxacin, ofloxacin, and ciprofloxacin, in pharmaceuticals and blood serum by HPLC ［J］. Anal Bioanal Chem,2003,375(5):623～629.

［8］ 王野，刘峥，刘峰. 高效液相色谱法同时快速测定喹诺酮类药物帕珠沙星、洛美沙星、左氧氟沙星的含量［J］. 抗生素杂志，2006，31(7)：40～42.

［9］ El?Kommos M E, Saleh G A, El?Gizawi S M, et al. Spectrofluorometric determination of certain quinolone antibacterials using metal chelation ［J］. Talanta,2003,60(5):1033～1050.

［10］ Du L M, Yang Y Q, Wang Q M. Spectrofluorometric determination of certain quinolone through charge transfer complex formation ［J］. Anal Chim Acta,2004,516(1～2):237～243.

［11］ 冯琳，储秋萍，邵志高. 荧光分光光度法测定盐酸洛美沙星胶囊含量［J］. 中国抗生素杂志，1996，21(1)：17～19.

［12］ Rizk M, Belal F, Aly F A, et al. Differential pulse polarographic determination of ofloxacin in pharmaceuticals and biological fluids ［J］. Talanta,1998,46(1):83～89.

［13］ Radi A, El?Sherif Z. Determination of levofloxacin in human urine by adsorptive square?wave anodic stripping voltammetry on a glassy carbon electrode ［J］. Talanta,2002,58(2):319～324.

［14］ Vllchez J L, Araujo L, Prieto A, et al. Differential?pulse adsorptive stripping voltammetric determination of the antibacterial lomefloxacin ［J］. J Pharm Biomed Anal,2001,26(1):23～29.

［15］ Liang Y D, Song J F, Ya X F. Flow?injection chemiluminescence determination of fluoroquinolones by enhancement of weak chemiluminescence from peroxynitrous acid ［J］. Anal Chim Acta,2004,510(1):21～28.

［16］ Yi L, Zhao H C, Chen S L, et al. Flow?injection analysis of two fluoquinolones by the sensitizing effect of terbium(III) on chemiluminescence of the potassium permanganate/sodium sulfite system ［J］. Talanta,2003,61(3):40～409.

［17］ Nie L H, Zhao H C, Wang X, et al. Determination of lomefloxacin by terbium sensitized chemiluminescence method ［J］. Anal Bioanal Chem,2002,374(7～8):1187～1190.

［18］ Rao Y, Tong Y, Zhang X R, et al. Flow?injection chemiluminescence determination of fluoroquinolones ［J］. Anal Lett,2000,33(6):1117～1129.

［19］ Zhang S S, Liu H, Wu Y J, et al. On?column amperometric detection of ofloxacin and pasiniazid in urine by capillary electrophoresis with an improved fractured joint and small detection cell ［J］. Analyst,2001,126(4):441～445.

［20］ Hernandez M, Borrull F, Calull M. Determination of quinolones in plasma samples by capillary electrophoresis using solid?phase extraction ［J］. J Chromatogr B,2000,742(2):255～265.

［21］ Solich P, Polasek M, Klimundova J, et al. Sequential injection technique applied to pharmaceutical analysis ［J］. Trends Anal Chem,2004,23(2):116～126.

［22］ 张龙，张成. 盐酸洛美沙星胶囊的紫外分光光度测定法［J］. 药物分析杂志，1999，19(3)：201～202.

［23］ 金鹏. 盐酸左氧氟沙星胶囊含量测定方法的改进［J］. 海峡药学，2005，17(5)：63～64.

［24］ 中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)［S］. 北京：化学出版社，2000:711