商品佛手和香椽rDNA ITS-RFLP鉴别研究

                       作者：高晓霞　陈晓颖　罗源生 

【摘要】  目的:利用ITS-RFLP技术对佛手及其近缘种香橼的商品药材进行快速的分子鉴定。方法:限制性内切酶AluI和MspI分别对商品佛手和香橼的ITS1和ITS2目的片断进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析。结果:5个商品佛手样品购自药材市场，ITS-RFLP酶切图谱显示可以对其进行分子鉴定。结论:利用ITS-RFLP方法可很好地快速区分佛手与香橼。

【关键词】  佛手;香橼;rDNA ITS序列;JTS-RFLP方法

　　本文将利用已建立的ITS-RFLP技术，对商品佛手和香橼进行RFLP分析，根据酶切后的电泳结果准确、快速地鉴别商品佛手。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 材料与试剂

　　佛手与香橼新鲜植物材料由广东省中药研究所华南中药种植资源库于2005年4月28日提供。本研究中编号为S1-S5的5份佛手市售药材购自广州清平药材市场，经鉴定其中S1和S4为佛手（Citrus medical L.var.sarcodactylis（Noot.）Swingle），S2，S3和S5为香橼（C.medical L.）。

    ExTag DNA聚合酶（TakaRa），琼脂糖（Promega），限制性内切酶Alul、Mspl（TaKaRa）。PE-480PCR扩增仪（PE），台式高速离心机（Sigma），恒压恒流电泳仪（Life Technologies），凝胶成像仪（Kodak EDAS120）。

    1.2 方法

　　新鲜植物叶片各0.1g，采用改良的CTAB法提取总DNA［1］。PCR反应在20μL体系中含10×Buffer2μl，10mmol.L dNTP0.5μl，25mmol.L Mg2+ 2.4μL，10μmol.L引物各1μL，DMSO1μL，ExTaq（5U.μL）0.1μL，DNA模板（适宜浓度）2μL，灭菌三蒸水（3dH2 O）10μL。PCR扩增条件为94℃变性4min，94℃1min，50℃2min，72℃2min，循环30次;72℃延伸10min，以3dH2 O代替模板DNA作空白对照。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析。rDNA ITS区通用扩增引物18Sp48和26Se37由上海生工生物工程有限公司合成。18Sp48:5'-AGAAGTCGTAA-CAAGGTTTCCGTAGG-3';26Se37:5'-TTCTCCGCTTATT-GATATGC-3'。

    RFLP分析中所用的限制性内切酶为AluI和Ms-pI。10μL反应体系，含10×Buffer1μL，限制性内切酶0.5μL，PCR纯化产物5μL，BSA1μL（如限制性内切酶buffer需要加BSA时），3dH2 O补足至10μL，37℃恒温水浴3～6h。取5～8μL用2%琼脂糖凝胶电泳检查酶切结果，人工比较分析RFLP带型图谱。

　　2 结果
    
　　限制性内切酶AluI的识别位点为ag.ct，MspI的识别位点为c.cgg，在佛手和香橼rDNA ITS-RFLP初步分析其中内切酶酶切图谱是有差异的。
    应用已建立的rDNA ITS-RFLP方法对5份佛手和香橼市售商品药材进行鉴定研究。在研究中，由于部分商品药材较难获得PCR产物，设计了5Sp15r和5SF31引物［2］，分别扩增ITS1（18Sp48，5Sp15r）和ITS2（5SF31，26Se37）片断，获得的PCR产物经测序分析为柑橘属植物rDNA ITS序列。5Sp15r:5’-GAT-GCGAGAGCCGAGATATCCGTTG-3’;5Sf31:5’-GCATCG-ATGAAGAACGCAGC-3’。
    Webcutter2.0程序（http:..rna.lundberg.gu.se.cut-ter2.）分析结果表明，限制性内切酶AluI的酶切位点在佛手和香橼的ITS1区，MspI酶切图谱的差异主要在ITS2区。分别利用AluI对样品的ITS1，MspI对样品的ITS2扩增产物进行RFLP鉴定（图略）。
     
　　3 讨论
     
　　ITS-RFLP技术结合PCR和RFLP的优点，对外形上较易混淆种类的鉴定具有快速，重现性好，且价廉省时等优点。本文是在佛手和香椽新鲜叶片经PCR产物直接测序，ITS-RFLP分析的基础上，对市售的商品佛手作进一步的鉴定研究。 中药材商品往往由于采集、加工、贮存等因素，其中的DNA都会或多或少的降解，较难获得PCR产物。许多学者在进行植物研究中意想不到地获得真菌的基因序列，如张婷等［3］ 在药用植物石斛的PCR-RFLP鉴别研究中发现干燥时间较长或者商品石斛进行PCR扩增时仅得到真菌序列。分析主要的原因可能是:CTAB法和其它相似的DNA提取方法所获得的植物基因组DNA不能区别植物和真菌的DNA;另外，在很多基于分子技术的研究中PCR引物往往是“通用”引物，扩增结果使得真菌和植物的目的片断均被扩增出来。植物表面的真菌可以利用不同的表面灭菌技术去除，而植物内生真菌不能应用这种技术除掉，应该尽量应用特异性的PCR引物，从而克服植物内生真菌的干扰。本研究中植物总DNA提取前参照Ro-drigues组织培养表面消毒技术去除植物表面的孢子和菌丝体;另外研究中应用的三对PCR引物，均为被子植物通用引物，可以避免植物内生真菌对PCR扩增结果的干扰。
    本文利用了ITS-RFLP技术鉴别药用植物佛手和香橼，虽然此方法操作简便、快速、更利于实际应用，但该方法仅局限于外观形态易混淆的物种，需要结合形态学鉴定方法。
【】
  　　［1］严寒静，高晓霞，陈晓颖.陈皮总DNA提取方法的研究［J］.广东药学院学报，2004，20（6）:592-593.

［2］曾 明，马雅军，郑水庆，等.中药葛根及其近缘种的rDNA-ITS序列分析［J］.药学杂志，2003，38（3）:173-175.

　　［3］张 婷，徐珞珊，王峥涛.药用植物束花石斛、流苏石斛及其形态相似种的PCR-RFLP鉴别研究［J］.药学学报，2005，40（8）:728-733.