人血浆中穿心莲内酯的HPLC?MS测定及生物等效性研究

                作者：张志华，何周康，周彦彬，厉宇红，田娟，左英，丁劲松

【摘要】  目的：建立人血浆中的穿心莲内酯的HPLC?MS测定法，研究两种穿心莲内酯分散片的相对生物利用度。方法：血浆样品液液萃取后，进行LC?MS分析，色谱柱为汉邦C18柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm），流动相为甲醇?水（72∶28，v/v），检测离子为m/z 373. 6（穿心莲内酯）、m/z 267.7（奈韦拉平，内标）。20名健康志愿者采用随机交叉方式分别单次口服穿心莲内酯分散片T或R各0.15 g，在不同时间点取血，样品以新建立的HPLC?MS法测定，研究比较两制剂的药动学参数及相对生物利用度。结果：穿心莲内酯在1.343～268.6 μg/L浓度范围内与峰面积比线性良好，最低定量浓度为1.343 μg/L。方法回收率为95.7%～104.7%，日内RSD小于6.4%，日间RSD小于12.4%。单剂量口服穿心莲内酯分散片T和R 0.15 g后两种制剂的Cmax 为（114.26±37.20）μg/L、（107.95±32.44）μg/L、；Tmax为（1.0±0.3）h、（1.1±0.3）h；AUC0?36 为（375.96±89.86）μg·h/L、（368.84±89.14）μg·h/L；AUC0?∞为（388.39±91.14）μg·h/L、（382.81±97.14）μg·h/L；T1/2为（7.65±2.24）h、（7.90±2.16）h。结论：该方法选择性好，灵敏度高，可用于穿心莲内酯的体内过程研究。药动学参数经方差分析表明，穿心莲内酯分散片T和R中穿心莲内酯的主要药动学参数之间差异均无统计学意义，双单侧t检验结果表明两制剂为生物等效制剂。

【关键词】  穿心莲内酯；HPLC?MS法；生物利用度；生物等效性

　　［Abstract］Objective: To develop an HPLC?MS method to determine andrographolide in plasma and evaluate the bioavailability of andrographolide dispersible tablets. Methods: Sample preparation was based on liquid?liquid extraction. The compounds were separated on a Hanbon C18 column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) with mobile phase of methanol?water (72∶28, v/v) and analyzed by MS detector. Nevirapine was the internal standard and the target ions were m/z 373.6 for andrographolide and m/z 267.7 for the internal standard. In a randomized crossover design, 20 healthy male volunteers were given 0.15 g andrographolide dispersible tablets T (test drug) or R (reference drug). The plasma samples were obtained and determined by the newly?developed HPLC?MS method and the pharmacokinetics and bioavailability were studied. Results: The calibration curve of andrographolide were liner within the range of 1.343～268.6 μg· L-1 with the limit of quantity 1.343 μg·L-1, the methodology recoveries were in the range of 95.7%～104.7%. Inter?day and intra?day RSDs were less than 6.4% and 12.4%, respectively. Pharmacokinetic parameters of andrographolide after a single dose of T and R were as following: Cmax were (114.26±37.20) μg·L-1 and (107.95±32.44) μg·L-1; Tmax were (1.0±0.3) h and (1.1±0.3) h; AUC0? 36 were (375.96±89.86) μg·h·L-1 and (368.84±89.14) μg·h·L-1; AUC0?∞  were (388.39±91.14) μg·h·L-1 and (382.81±97.14) μg ·h· L-1; t1/2 were (7.65±2.24) h and (7.90±2.16) h. Conclusions: The method is selective, sensitive and rapid for andrographolide determination. The results of ANOVA analysis and two one?side t tests show that there is no significant difference between the pharmacokinetic parameters of the two formulations and bioequivalence is observed.

　　［Key words］Andrographolide; HPLC?MS; Bioavailability; Bioequivalence

　　穿心莲内酯（Andrographolide）是从中草药穿心莲中提取的纯中药的有效单体，为穿心莲的主要活性成分之一，在穿心莲中含量较高，且毒性最低［1］，是临床上应用有效的清热解毒、抗菌消炎药。但由于穿心莲内酯的水不溶性，单体穿心莲内酯较提取物在体内吸收差，血药浓度达不到浓度而导致临床疗效不稳定，故将其加工为分散片以加大溶解度和溶出速率［2］。国内多采用HPLC法测定动物体内的穿心莲内酯的血药浓度［3?6］。由于仪器灵敏度的限制，难以满足该制剂在人体内的完整药时曲线的测定与药物动力学研究。本文采用HPLC?MS联用技术，建立了简便、灵敏的体内分析方法，为穿心莲内酯的人体药代动力学研究提供可靠的检测手段，并以此法研究了两种穿心莲内酯分散片的相对生物利用度。

　　1  实验部分

　　1.1  仪器与试剂

    Waters ZQ2000液相色谱?质谱联用仪（含二元高压泵、自动进样器、柱温箱、电喷雾离子化接口、2695液相色谱仪）；Masslynx 4.0高级色谱工作站；美国Millipore超纯水仪；METTLER天平；AllegraTM 64R Centrifuge台式高速冷冻离心机（BECKMAN COULTERTM）；旋涡混合器（上海分析仪器厂）。

    穿心莲内酯对照品（天津市汉康医药生物技术有限公司提供，含量99.6%）；奈韦拉平（内标，南京第一提供）；穿心莲内酯分散片R（50 mg/片，江西青峰药业有限公司，批号20050711）。穿心莲内酯分散片T（50 mg/片，天津市汉康医药生物技术有限公司试制，批号050324）。甲醇（色谱纯，TEDIA Company）；水为纯化水；其它试剂均为国产分析纯（AR级）。

　　1.2 色谱条件及血样处理

　　1.2.1 色谱条件 

　　汉邦C18柱（4.6 mm×150 mm, 5 μm）；柱温：25 ℃；流动相： 甲醇?水（72∶28，v/v）；流速：1.0 mL/min分流进样。

　　1.2.2 质谱条件 

　　毛细管电压：3.50 KV；锥孔电压：35 V；干燥气流速：500 L/h；离子源温度：120 ℃；辅助气温度：380 ℃；离子检测方式：选择性离子检测（SIM）；离子极性：正离子（positive）；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化（ESI）；检测对象：穿心莲内酯，［M+Na］+，m/z 373.6；内标：奈韦拉平，［M+H］+，m/z 267.7。

　　1.2.3 血样处理 

　　准确吸取血浆0.5 mL，置10 mL具塞尖底离心管中，加入内标（1.068 μg/mL）100 μL，漩涡振荡1 min，加入乙酸乙酯2.5 mL，漩涡振荡3 min，4 000 r/min离心10 min，吸取有机相于另一离心管中，50 ℃水浴氮气吹干。残渣用150 μL流动相溶解，进样20 μL。

　　1.3 试验方案

    试验经中南大学伦理委员会批准，20名健康男性志愿者，年龄（22.2±1.4）岁，体重（58.5±5.7）kg，经签署知情同意书和体检合格后纳入试验。志愿者随机等分为两组，禁食12 h后，于清晨分别单次口服穿心莲内酯片T或R 0.15 g，于服药前及服药后0.25 h、0.5 h、0.75 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h，8.0 h、12.0 h、24.0 h、36.0 h各抽取肘静脉血4 mL。一周后交叉服药，取血方法和时间相同。采集的血样标本置于肝素化试管中，在-20 ℃保存待测。

　　1.4 数据处理

    药代动力学参数Cmax、tmax由血药数据直接读取。AUC0?t以梯形面积法，消除速率常数K以血药浓度?时间曲线尾部数据回归计算。AUC0?t和Cmax经对数转换后进行药物间、周期间、个体间的三因素方差分析，再以双单侧t检验进行生物等效性判定。

　　2 结果

　　2.1 色谱行为

    在选定的条件下，穿心莲内酯和内标峰形良好，穿心莲内酯和内标的保留时间均为2.1 min左右，内源性杂质不干扰测定。空白血样、穿心莲内酯对照品及内标、空白血样中加入对照品和受试者服药后血样色谱图见图1。

　　2.2 线性范围

    取空白血浆分别配制成含穿心莲内酯分别为1.343 μg/L、4.029 μg/L、13.43 μg/L、26.86 μg/L、67.15 μg/L、134.3 μg/L、268.6 μg/L的系列标准血浆样品，余照“血样处理”项下方法操作并测定。记录色谱图，以穿心莲内酯面积与内标峰面积比值（Y）与血药浓度（X）进行线性回归，得回归方程：Y=0.022253X+0.017778， r=0.9992。穿心莲内酯浓度在1.343～268.6 μg/L范围内与峰面积比线性良好，最低定量浓度为1.343 μg/L。

　　2.3 回收率与精密度试验

　　2.3.1 绝对回收率 

　　用空白血浆配制穿心莲内酯浓度为4.029 μg/L、26.86 μg/L、134.3 μg/L的血样各5份，按“血样处理”项下平行操作，进样20 μL，记录穿心莲内酯和内标峰面积；另配制穿心莲内酯浓度为4.029 μg/L、26.86 μg/L、134.3 μg/L的甲醇溶液，每份0.5 mL，加入内标溶液（1.068 μg/mL）100 μL，40 ℃水浴氮气吹干，残渣用150 μL流动相溶解，进样20 μL，记录穿心莲内酯和内标色谱峰面积。以血浆样品测定的峰面积除以同浓度的甲醇溶液峰面积所得百分率绝对回收率，结果穿心莲内酯低、中、高浓度绝对回收率分别为78.0%±4.0%、78.0%±3.0%、88.1%±4.2%（n=5）。

　　2.3.2 相对回收率及精密度 

　　用空白血浆配制穿心莲内酯浓度为4.029 μg/L、26.86 μg/L、134.3 μg/L的血样各5份，按“血样处理”项下平行处理后进样，在一天内测定5次，由标准曲线计算各样品的浓度，以测得值与加入值之比计算回收率，并计算日内精密度，结果各浓度的回收率为95.7%～104.7%（n=15），日内RSD为2.4%～6.4%。上述样品连续测定3天，计算日间精密度，结果日间RSD为6.3%～12.4%。

　　2.4 稳定性试验

    用空白血浆配制穿心莲内酯浓度为4.029 μg/L、26.86 μg/L、134.3 μg/L的血样，在室温条件下放置4 h；在-20 ℃冰箱中冷冻后取出，室温融化，重复操作3次；-20 ℃冰箱中放置30 d，血样提取后于4 ℃自动进样器中放置12 h，分别在不同时间点取样测定，结果样品在室温4 h内，在3次冻融过程中，在冷冻条件下放置30 d以及血样提取后于4 ℃自动进样器中放置12 h稳定（RSD≤7.2%）。

　　2.5  两种穿心莲内酯片的相对生物利用度

　　2.5.1  血药浓度?

　　时间曲线  20名受试者单剂量给予穿心莲内酯分散片T和R各0.15 g后全血中穿心莲内酯的平均药?时曲线见图2。

　　2.5.2 药物动力学参数

    20名健康志愿受试者单剂量口服穿心莲内酯分散片T和R各0.15 g后的平均药动学参数见表1。表1  单剂量口服穿心莲内酯分散片T和R后平均药物动力学参数（略）

    穿心莲内酯分散片T和R的AUC0?36、Cmax经对数转换后，进行方差分析，结果表明：两种制剂中穿心莲内酯的主要药动学参数之间差异均无统计学意义（P>0.05），非参数检验未发现两种制剂Tmax之间差异有统计学意义，两制剂为生物等效制剂（t1、t2均>t0.05）。与R相比，T的相对生物利用度为101.1%±7.9%。试验制剂的Cmax的均值落在参比制剂Cmax均值的93.32%～119.40%之间，AUC0?36的均值落在参比制剂AUC0?36均值的97.72%～104.69%之间。

　　3 讨论

    本研究采用HPLC?MS法测定人血浆中的穿心莲内酯，药物和内标的保留时间均为2.1 min左右，操作简单快速，定量限为1.3 μg/L，灵敏度高，适合穿心莲内酯体内过程研究。

    20名健康受试者单次口服穿心莲内酯分散片T和R 0.15 g后，吸收较快，约1.0 h血药浓度达到峰值。药物峰浓度、吸收总量与同剂量（以穿心莲内酯计）的穿心莲提取物给药相比明显降低，显示中药提取物较优的促吸收作用［7］，但与同制剂的药动学参数相近［8］。两制剂在人体内吸收过程相当，生物利用度无明显差异，两种穿心莲内酯分散片为生物等效制剂。

    但本试验发现计算的半衰期较［8］为短，主要是因为在生物等效试验中，主要考察药物在吸收过程中的差异，实验设计取样点主要考虑吸收相，对消除相的时间点安排不同，因此，出现药物半衰期计算结果的差异。

【文献】
  　　［1］洪馨, 宓穗卿, 叶少梅, 等. 穿心莲胶囊与穿心莲丸生物利用度的比较研究［J］. 中药新药与临床药理, 2000, 11(1): 8?10.

　　［2］陈鹰, 匡长春, 宋琪, 等. 分散片的研究与应用［J］. 药师, 2001, 4(1): 62?64.

　　［3］韩凤梅, 蔡文涛, 夏启松, 等. 穿心莲片中脱水穿心莲内酯在大鼠血浆中的药代动力学［J］. 中华中医药杂志, 2005, 20(4): 206?209.

　　［4］杜红, 牛欣, 冯前进, 等. 穿心莲内酯口服微乳与穿心莲内酯片在家兔体内生物利用度的比较研究［J］. 中药新药与临床药理, 2007, 18(3): 217?219.

　　［5］祝晨蔯, 莫建霞, 桂蜀华, 等. 家兔血清中穿心莲内酯的血药浓度测定［J］. 中药药理与临床, 2002, 18(4): 9?11.

　　［6］金晶, 赵钟祥, 晏菊娇, 等. 亚硫酸氢钠穿心莲内酯在Beagle犬体内的药动学研究［J］. 医药导报, 2005, 24(2): 109?111.

　　［7］Panossian A, Hovhannisyan A, Mamikonyan G, et al. Pharmacokinetic and oral bioavailability of andrographolide from Andrographis paniculata fixed combination Kan Jang in rats and human ［J］. Phytomedicine, 2000, 7(5): 351?364.

　　［8］邹建军, 顾小祥, 朱余兵, 等. 穿心莲内酯分散片的药动学与生物等效性［J］. 中国医药杂志, 2007, 38(7): 506?509.