高效液相色谱法测定氯法拉滨注射液中氯法拉滨的含量
作者：王娟，张蓉，赵艳艳，卢来春
【摘要】 目的：建立高效液相色谱法测定氯法拉滨注射液中主药氯法拉滨的含量。方法：采用Shim?pack VP?ODS（5 μm，4.6 mm×150 mm）色谱柱，流动相为乙腈?乙酸铵溶液（取乙酸铵0.31 g，加水溶解并稀释至1 000 mL，再加甲酸1.0 mL）（10∶90），流速1.0 mL/min，进样量20 μL，检测波长262 nm。结果：氯法拉滨在进样量0.4～242.5 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为A=23156C+12378（r=0.9999，n=5），平均加样回收率为99.97%，RSD为0.40%。结论：本方法快速、简便、结果准确，可用于控制该制剂的质量。
【关键词】 高效液相色谱法；氯法拉滨；含量测定
［Abstract］Objective:To establish a high performance liquid chromatograph (HPLC) method to assay the concentration of clofarabine in clofarabine injection. Methods: Shim?pack VP?ODS (5 μm, 4.6 mm×150 mm) column and a mobile phase of acetonitrile?ammonium acetate solution (water containing 4 mmol/L ammonium acetate and 0.1% of formic acid) (10∶90) were used with the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wave length was 262 nm. Results: There was a linear relationship within the range of 0.4～242.5 μg/mL and the regression equation was A=23156C+12378 (r=0.9999, n=5). The average relative recovery rate was 99.97% and RSD was 0.40%. Conclusions: This method is simple, accurate and able to control the quality of the preparation.
［Key words］High performance liquid chromatograph; Clofarabine; Determination
氯法拉滨由美国Genzyme公司研发，并由美国FDA通过快速审批程序于2005年1月11日上市，作为近十年来首个获准专门用于儿童白血病的新药，主要用于治疗儿童难治性或复发性急性淋巴细胞性白血病（ALL），患儿此前至少已接受过两种疗法治疗而无效者［1?4］。目前，氯法拉滨国内无上市产品，为更好地控制本品质量，本实验建立了氯法拉滨的含量测定方法，并经方法学考察，认为本法简便快捷，结果准确，可用于氯法拉滨注射液的质量控制。
1 仪器与试药
岛津LC?10ATvp高效液相色谱仪，SPD?10A紫外可见光检测器；氯法拉滨对照品（第三军医大学新桥药学部合成并精制，纯度为99.85%），氯法拉滨注射液（第三军医大学新桥医院药学部制备；规格：20 mL∶20 mg；批号080505、080506、080507）；乙腈为色谱纯，乙酸铵、甲酸为分析纯，水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Shim?pack VP?ODS（C18，5 μm，4.6 mm×150 mm）；流动相：乙腈?乙酸铵溶液（取乙酸铵0.31 g，加水溶解并稀释至1 000 mL后，再加甲酸1.0 mL）（10∶90）；流速1.0 mL/min；检测波长262 nm；进样量20 μL。理论板数按氯法拉滨为8 966，拖尾因子为1.136。此条件下，氯法拉滨主峰与各杂质峰达到基线分离。
2.2 对照品储备液的配制
精密称取氯法拉滨对照品121.25 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成约含氯法拉滨1.2125 mg/mL的对照品贮备液，备用。
2.3 供试品溶液的配制
取氯法拉滨注射液20 mL，置100 mL容量瓶中，加水稀释定容，制成每毫升含氯法拉滨200 μg的溶液，摇匀，备用。
2.4 阴性对照溶液的制备
氯法拉滨注射液其主要辅料是氯化钠。取氯化钠适量，按处方比例加水稀释成0.9%的溶液，滤过，备用。
2.5 阴性对照试验
按照上述色谱条件，吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，结果见图1。阴性对照溶液中的组分不干扰供试品溶液中氯法拉滨的测定。氯法拉滨的保留时间约为10.1 min。
2.6 标准曲线
精密量取对照品贮备液，分别稀释制成含氯法拉滨0.4、1.94、9.7、48.5、242.5 μg/mL的溶液，照上述色谱条件，分别精密吸取上述溶液20 μL进样，记录色谱图，以峰面积A为纵坐标，对照品溶液浓度C（μg/mL）为横坐标，面积归一法得氯法拉滨的线性回归方程为：A=23156C+12378（r=0.9999，n=5）。结果表明氯法拉滨浓度在（0.4～242.5）μg/mL范围内溶液浓度与峰面积线性关系良好。
2.7 精密度试验
精密移取对照品储备液20 mL，置100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，得浓度为242.5 μg/mL对照品溶液，取上述溶液20 μL，一天内重复进样6次，测得各峰面积分别为5574317、57293095、5574276、5700138、5518083、5525308，以峰面积精密度，结果日内RSD为1.6%。
2.8 回收率试验
取氯法拉滨对照品约16 mg、20 mg和24 mg各三份，精密称定，按处方比例，加入辅料氯化钠适量，按拟定方法测定含量，并做氯化钠的空白测定，计算回收率，结果见表1。本法测定氯法拉滨含量，平均回收率在99.0%～100.8%之间，RSD小于1.0%，符合含量测定要求。表1 回收率试验结果(略)
2.9 稳定性试验
取样品（批号080505），按“2.3”项下方法操作，室温放置，分别在0、4、8 h进样20 μL，记录色谱图，结果主峰氯法拉滨的峰面积分别为5357604、5231527、5369068，RSD为1.4%。表明供试品溶液在配制后室温8 h内稳定性较好。
2.10 样品测定
取3批不同批号的样品，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件进样20 μL，测定3批样品含量，结果见表2。3批样品含量均在95.0%～105.0%范围内。表2 样品含量测定结果(略)
3 讨论
本试验在小鼠血浆中氯法拉滨含量测定方法［5］基础上，以文中色谱条件测定氯法拉滨注射液主药氯法拉滨的含量，供试品溶液中其他杂质峰不影响主成分峰的含量测定，试验结果准确，方法快速、简便，可用于控制氯法拉滨注射液的质量。
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