人肺表面活性物质相关蛋白A的提纯与生物活性分析

       作者：薛立军，陈志远，封志纯，张志浩，杜江，陈刚，袁扬，黄京慧，马国宣，车审言

【摘要】  　　目的：提取煤工尘肺患者双肺大容量灌洗回收液中肺表面活性物质相关蛋白A（SP?A）。方法：利用离心、透析，制备亲和层析柱提纯SP?A，利用ELISA法鉴定，高效液相色谱法测定含量和纯度，膜天平测定活性。结果：所提纯SP?A含量平均为每人次（1.3692±0.3885）g，纯度（92.20±7.00）%。加入PS+SP?A较单纯加入PS显著改变了膜表面张力，方差分析显示P<0.05，差异有统计学意义。结论：本试验较好地提纯SP?A并保持活性，方法可行。

【关键词】  肺表面活性物质相关蛋自A 人 提纯 分析
   
　　［Abstract］ Objective:To extract pulmonary surfactant?associated protein A (SP?A) from derelict whole?lung lavage (WLL) liquid of coal worker patients with pneumoconiosis. Methods: SP?A was purified from the primary production, with its contents and purity determined with chromatogram, and identified with ELISA, and analyzed with JM04 dynamic tension recorder. Results: The average content of SP?A was (1.3692±0.3885) g from each patient, and (92.20±7.00)% in extracted samples. The average surface tension was changed by SP?A. Statistical test showed P<0.05 among three groups. Conclusions: It is feasible to extract SP?A with its activity well kept in the way shown in this test.

　　［Key words］ Pulmonary Surfactant?associated Protein A; Human; Extraction; Analysis
   
　　肺表面活性物质相关蛋白A（Pulmonary Surfactant?associated Protein A，SP?A）是肺表面活性物质（Pulmonary Surfactant，PS）的主要蛋白成分，制备人SP?A对PS基础研究和临床应用具有重要意义［1?4］。2006年10月我们以抗人SP?A单克隆抗体制作亲合层析柱达到了提纯人源性SP?A的目的，报道如下。

　　1  材料、试剂和仪器

　　1.1  材料和试剂
   
　　2006年10月随机收集8例煤工尘肺（Coal Workers? Pneumoconiosis，CWP）患者双肺大容量灌洗（Whole?Lung Lavage，WLL）回收液（源于国家煤矿安全监察局尘肺病康复中心），每例患者灌洗回收液约24 000 mL。琼脂糖凝胶4B（Sepharose 4B）、溴化氰（CNBr）、PS?Exsurf（系人工合成PS，其主要成分为磷脂二棕榈卵磷脂DPPC，美国Glaxo Wellcome产品）、抗人SP?A单克隆抗体（抗人SP?A mAbs），以上均由南方医科大学珠江儿科实验室惠赠。SP?A抗体（ELISA法检测鉴定产品用，购自Sigma 公司）。

　　1.2  仪器
   
　　紫外分光光度计HD?21?2，高效液相色谱仪（上海沪西青浦仪器厂），自动波长分光光度计754型（上海菁华科技仪器有限公司）等。

　　2  方法

　　2.1  初步提取
   
　　过滤24 000 mL肺灌洗液，离心（3 000 r/min，15 min），去渣，利用孔径14 kDa 的透析袋浓缩到100 mL左右，离心（10 000 r/min，15 min），取上清液。

　　2.2  纯化
   
　　上清液过CNBR?sepharose CL?4B亲和层析柱，纯化SP?A产品。

　　2.2.1  制备CNBR?sepharose CL?4B亲和层析柱  （1）琼脂糖活化：取20 mL Sepharose 4B置布氏漏斗中抽干，加少量的0.1 mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤，转入100 mL烧杯中，冰浴，置磁力搅拌器上；称取2 g溴化氰，溶于20 mL水，倒入琼脂糖中，滴加 2 mol/L NaOH，保持 pH 11.0，反应 10 min；调整 pH为8.0～11.0 维持10 min；将活化琼脂糖迅速倒入布氏漏斗，冰水抽洗成中性，以250 mL 0～4 ℃的0.1 mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。（2）偶联蛋白：取20 mL 4B液体。先将需偶联的抗人SP?A mAbs 200 mg 置于0.1 mol/L pH 9.0 NaHCO3 液中透析数小时；将活化琼脂糖迅速倒入蛋白液中（从抽洗到偶联在1.5 min内），4 ℃搅拌过夜，使蛋白与活化琼脂结合。（3）装柱及洗柱：将与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱，流速1 mL/min；洗柱：以0.2 mol/L pH 9.0 NaHCO3洗涤至洗出液的OD280<0.02为止。

　　2.2.2  色谱纯化  （1）吸附：按床体积1/10上样，先用SP?A标准品，确定产品SP?A出峰时间。用浓度1%～2% 0.01 mol/L pH 7.4 PBS液洗脱，流速为1 mL/min，至洗出液OD280<0.02为止；（2）解吸附和收集：加0.1 mol/L pH 2.4甘氨酸?HCl缓冲液，流速1 mL/min，收集后立即以1 mol/L NaHCO3中和到pH 7.0；（3）洗柱、再纯化和保存：用0.01 mol/L pH 7.4 PBS液洗涤色谱柱，平衡后继续使用。按上述方法上样，样品为“2.1”项下初提的上清液，缓慢加入，反复上述PBS液洗脱杂蛋白、甘氨酸?HCl缓冲液洗脱SP?A等步骤，等待SP?A标准品相同时间峰收集洗脱液、合并，透析浓缩。加入0.02% NaN3于4 ℃保存。

　　2.3  鉴定与生物活性分析
   
　　ELISA方法定性鉴定SP?A；考马斯亮蓝法检测产品总蛋白含量；高效液相色谱法测定产品SP?A含量、纯度（与SP?A 标准品峰面积比较，得到产品SP?A含量、纯度）。
   
　　SP?A活性测定：用MTP?1型膜天平测定液体表面张力，比较产品SP?A生物活性。选择8例CWP患者WLL液所提纯的SP?A产品，先后在蒸馏水中加入PS（Exsurf，DPPC）50 μL，8例产品SP?A 50 μL，形成自身对照的3组液体表面张力数据：A组8例蒸馏水、B组8例蒸馏水+PS 50 μL、C组8例蒸馏水+PS 50 μL+8例产品SP?A 50 μL。

　　2.4  统计学分析  实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 13.0统计软件处理，三组间均数比较采用单向方差分析（ONE?WAY ANOVA，LSD法），取α=0.05。

　　3  结果

　　3.1  ELISA鉴定
   
　　结果见表1。

　　表1  ELISA定性鉴定SP?A（略）

　　注：1～8为8例SP?A产品，9为SP?A标准品，10为空白对照

　　3.2  SP?A含量
   
　　根据色谱峰面积。SP?A标准品、样品1的色谱图分别见图1和图2。

　　峰面积：155 182，含量：0.50 g

　　图１  SP?A标准品色谱图（略）

　　峰面积：531 705，含量：1.7131 g

　　图２  样品1  SP?A色谱图（略）

　　3.3  样品纯度
   
　　8例产品SP?A含量、纯度见表2。

　　表2  样品蛋白总量和SP?A含量表（略）

　　3.4  体外活性测定

　　3.4.1  表面活性比较  结果见表3。

　　表3  A、Ｂ、Ｃ组的表面活性比较（略）

　　注：和A组比较，*P<0.05，**P<0.01；Ｃ组和B组比较，#P<0.05，##P<0.01。

　　3.4.2  体外活性测定曲线  3组表面张力曲线变化见图3、图4和图5。

　　图3  Ａ组表面活性曲线（略）

　　图4  Ｂ组表面活性曲线（略）

　　图5  Ｃ组表面活性曲线（略）

　　4  讨论
   
　　SP?A是PS的主要蛋白成分，制备人SP?A对基础研究和临床应用具有重要意义［1?4］。天然PS存在于肺泡和终末呼吸道表面，由Ⅱ型细胞分泌，随呼吸时肺泡表面积变化来改变气液界面的张力，使肺泡在呼气时不致萎陷。人工合成磷脂配方（DPPC∶PG）缺乏肺表面活性物质蛋白，疗效远没有天然PS好。天然的人PS从羊水中得来，获取困难［3?10］。本试验试图变废为宝，从人肺灌洗液得到人SP?A。
   
　　本试验利用抗人SP?A mAbs制备亲和层析柱，通过抗原?抗体特异性结合，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到纯化SP?A的目的。根据ELISA方法鉴定SP?A，其显色甚至优于标准品，说明产品的抗原性经过提取工艺没有显著破坏。产品每人次灌洗回收液24 000 mL可以回收SP?A（1.3692±0.3885） g，纯度达到92.20%±7.00%，优于其他报道。
   
　　SP?A的生物功能在PS功能蛋白中是最广泛，也最重要的。本研究采用离心和透析的方法，实验条件温和，体外活性测定结果显示，SP?A显著影响PS对蒸馏水表面张力的改变，显著改善PS在蒸馏水表面的分布。说明提纯工艺能较好地保存SP?A的生物活性。
   
　　总之，本试验提取的SP?A数量大、纯度高、活性好，说明本试验方法在CWP患者WLL回收液中提纯SP?A可行，且产品含人同种异体蛋白，优于动物体内提取的异种蛋白。

【】
  　　［1］ 杨琳琳, 封志纯. 肺表面活性物质蛋白A的提纯及其表面活性功能分析［J］. 当代儿科杂志, 2000, 8(4): 260?262.

　　［2］ Morrow MR, Temple S, Stewart J, et al. Comparison of DPPC and DPPG environments in pulmonary surfactant models ［J］. Biophys J, 2007, 13: 164?175.

　　［3］ 邢景才, 范连生, 冯国贤, 等. 早期CWP支气管肺泡灌洗液中SP?A及TNF?α含量的变化［J］. 中华劳动卫生职业病杂志, 2001, 2(1): 47?49.

　　［4］ 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所. GBZ70 ?2002尘肺病诊断标准［S］. 北京: 出版社, 2002.

　　［5］ 薛立军, 陈志远, 封志纯, 等. 肺表面活性物质制备方法的改进和研究［J］. 临床儿科杂志, 2008, 26(9): 810?813.

　　［6］ Morrow MR, Abu?Libdeh N, Stewart J, et al. Interaction of pulmonary surfactant protein SP?A with DPPC/egg?PG bilayers［J］. Biophys J， 2003, 85(4): 2397?2405.

　　［7］ JM BAKKER, E BROUG?HOLUBB, H KROSE, et al. Functional immaturity of rat alveolar rmacrophages during postnatal development ［J］. Immunology J, 1998, 94: 304?309.

　　［8］ Kaushik Nag, Jesus Perez?Gil, Miguel LF Ruano, et al. Phase Transitions in Films of Lung Surfactant at the Air?Water interface ［J］. Biophysical Joumal, 1998, 74: 2983?2995.

　　［9］ 封志纯, 陈一方, 林敬明, 等. 肺表面活性物质研究进展［J］. 国外医学生理、病理与临床分册, 1997, 17(2): 165?168.

　　［10］ H Clark, K Reid. The potential of recombinant surfactant protein D therapy to reduce inflammation in neonatal chroniclung disease, cystic fibrosis, and emphysema ［J］. Arch Dis Child, 2003, 88: 981?984