丙戊酸代谢酶中CYP2C9、UGT1A6的基因多态性分析方法的建立

                        作者：何周康，赵昕，阳利龙，张志华 

【摘要】  目的：研究药物代谢酶基因多态性对丙戊酸钠代谢的影响，并建立分析丙戊酸代谢酶中CYP2C9、UGT1A6的基因多态性的方法。方法：从人全血中抽取gDNA，设计引物扩增CYP2C9及UGT1A6，并运用限制性片段长度多态性（RFLP）技术的方法进行CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*4、CYP2C9*5、UGT1A6*2和UGT1A6*3的分型。结果：成功设计了引物用来扩增包含CYP2C9*3、CYP2C9*4、CYP2C9*5的片断，并测序验证。结论：建立了简单可靠的RFLP基因分型方法。

【关键词】  丙戊酸钠；药物代谢酶；基因；多态性

    ［Abstract］ Objective:In order to study the effect of drug?metabolizing enzymes (DME) polymorphism on the metabolism of valproic acid (VPA), we set up a method to analyze the DME gene polymorphism. Methods:The GDNA were extracted from blood of human. The CYP2C9 and UGT1A6 gene were amplified with PCR. We used the restriction fragment length polymorphism (RFLP) to classify the CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C9*4, CYP2C9*5, UGT1A6*2 and UGT1A6*3 genotypes. Results:A successful design of the primers was used to contain expansion of CYP2C9 * 3, CYP2C9 * 4, CYP2C9 * 5 of the clips, and sequencing and verification were performed.Conclusions:We established a simple and reliable RFLP method to group the UGT1A6 and CYP2C9.

    ［Key words］ Valproic acid; Drug?metabolizing enzymes; Gene; Polymorphism

    丙戊酸钠（VPA）是儿童癫痫的常用药物，有效治疗浓度为50～100 μg/mL，但个体差异很大，服用相同的剂量后进行血药浓度监测，可以发现许多患儿的血药浓度低于50 μg/mL或高于100 μg/mL。VPA对消化系统、肝脏及血液系统均有潜在的毒性，甚至出现致死性肝坏死（多见于两岁以下儿童），严重影响VPA的临床应用。因此，为指导临床合理用药，减少不良反应，需了解VPA的药代动力学特点，进行个体化治疗。

    VPA在体内97％通过肝脏代谢，其中50％通过尿苷酸二磷酸葡萄糖醛酸酶（UGT）代谢（UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7），40％通过线粒体β氧化，而10％左右通过细胞色素P450代谢［1，4］，国外已有在体外运用肝微粒体孵育的方法对丙戊酸钠的代谢进行研究［4］，但是目前国内还很少有关于UGT基因多态性对丙戊酸钠代谢影响的体内体外研究。国外在体外的肝微粒体孵育试验中证明，VPA具有肝毒性的代谢产物为4?ene?VPA，这种产物主要由CYP2C9代谢产生［5］。而目前发现的几种CYP2C9基因突变中［6，7］，CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3代谢生成4?ene?VPA的水平有很大差异。因此，在体外体内研究CYP2C9基因多态性与肝毒性代谢产物的生成差异，有重要的临床意义。

    目前，有关UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7、CYP2C9、CYP2C19的基因多态性研究发现这些代谢酶存在许多单核苷酸突变位点（SNPs），而且其中很多突变影响了其代谢药物的能力［8?12］。我们希望通过我们的实验研究，建立一种快速、可靠、简便的基因分型方法，对这几种药物代谢酶进行基因分型，以指导临床个体化用药，做到用药合理安全。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验仪器  PB303?N精密天平［梅特勒?托利多仪器（上海）有限公司］；Thermo Hybaid P×2 梯度 PCR仪（Thermo Hybaid，USA）；DY Y?6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；自动电泳凝胶成像分析系统GDS?8000（UVP，USA）；小型高速离心机D?37520（Sigma，USA）；420三用恒温水箱。

    1.1.2  分子生物制剂  引物（上海英骏生物有限公司）；DNA 胶回收试剂盒（Omega，USA）；TaKaRa LA Taq酶及r Taq 酶；GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus（Fermentas）；内切酶（NEB）；其它试剂皆为国产分析纯。

    1.1.3  人全血标本  用一次性注射器，晨8点餐前采患者上臂静脉血5 mL置于EDTA抗凝管中，-20 ℃放置待进行基因组DNA提取。

    1.2  实验方法

    1.2.1  人血GDNA提取方法［13］   采用TKM?血液DNA 提取法。取2 mL含抗凝剂的全血加入2 mL已配制好的缓冲溶液Ⅰ（10 mmol Tris?HCl pH 7.4，10 mmol KCl， 10 mmol MgCl2，2 mmol EDTA) 和50 μL NP?40，旋涡振荡器上充分混匀，3 000 r/min 室温离心10 min，弃上清液，细胞沉淀中再加缓冲溶液Ⅰ，混匀后再离心，如此反复3～5 次直至上清液由红色变为无色。在含白细胞沉淀的试管中加入0.32 mL 溶液Ⅱ（溶液Ⅰ中加0.4 mol NaCl），将白细胞再悬浮，然后加入50 μL10% SDS 和0.30 mL 饱和NaCl 混匀，室温下轻摇过夜后，12 000 r/min 离心10 min，取上清加等量异丙醇或3倍体积的乙醇，摇匀，置-20 ℃1 h以上沉淀DNA，13 000 r/min 离心25 min，弃上清，再用80%的乙醇洗涤，同上离心10 min，DNA 沉淀风干后溶于50 μL消毒重蒸水中。

    1.2.2  引物设计

    根据Pubmed上获取的CYP2C9基因全序列（NM000771），设计所关注的CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*4和CYP2C9*5的引物，引物设计及酶切位点设计方法。因为CYP2C9*3、CYP2C9*4、CYP2C9*5同在一个外显子上且比较靠近，故选用同一引物。引物序列及其各个位点内切酶见表1。表1  CYP2C9引物序列及文献报道突变频率根据Pubmed上获取的UGT1A6的基因全序列（NM001072），设计所关注的UGT1A6*2和UGT1A6*3的引物，引物设计及酶切位点设计参照文献［3，8］。因为UGT1A6*2和UGT1A6*3同在一个外显子上，故选用同一引物。引物序列及其各个位点内切酶见表2。表2  UGT1A6引物序列及文献报道突变频率

    1.2.3  PCR反应体系、循环条件及酶切条件

    (1)CYP2C9

    CYP2C9*2：

    PCR的反应体系包括：10 mM Tris?HCl (pH 8.3)，50 mmol KCl，1.5 mmol MgCl2，200 mmol dNTP，200 nmol  primers，50 ng/mL BSA，100 ng的genomic DNA和1 unit Taq。

    PCR的循环条件为：

    94 ℃  5 min

    94 ℃  30 s

    61 ℃  45 s

    72 ℃  1 min 35 cycles 

    72 ℃  5 min

    PCR产物片断酶切条件：Ava Ⅱ 37 ℃，水浴4 h。

    CYP2C9*3、CYP2C9*4、CYP2C9*5：

    PCR的反应体系（25 μL体系）包括：12.5 μL buffer，PCR primers (10 pmol)，8.5 μL H2O，1.5 unit Taq酶和 40 ng的DNA。

    PCR的循环条件为：

    95 ℃  15 min

    94 ℃  30 s

    55 ℃  30 s

    72 ℃  45 s  40 cycles

    72 ℃  7 min

    因3个位点较近，酶切后未找到较好方法进行分辨，故采用测序。

    (2)UGT1A6

    UGT1A6*2、UGT1A6*3：

    PCR的反应体系同上。

    PCR的循环条件为：

    95 ℃   4 min

    95 ℃  30 s

    64 ℃  1 min

    72 ℃  1 min 35 cycles

    72 ℃  7 min

    Nsi Ⅰ 酶切 T181A 突变，Fnu4H Ⅰ 酶切 R184S 突变。

    PCR产物片断酶切条件：37 ℃水浴3 h。

    2  结果

    2.1  CYP2C9

    CYP2C9*2：

    PCR的产物为261 bp，经Ava Ⅱ酶切，并用3%琼脂糖胶电泳后，R144 C突变时，突变纯合子不被酶切为261 bp的单条带，野生型纯合子被酶切为223 bp和38 bp的两个条带，杂合子为261 bp、223 bp、38 bp三条带，见图1。

    2.2  UGT1A6

    PCR的产物为992 bp，分别经Nsi Ⅰ、Fnu4H Ⅰ 酶切，并用3%琼脂糖胶电泳后，T181A突变时，突变纯合子被酶切成616 bp和376 bp两个片断，野生型纯合子为992 bp一条带，杂合子为992 bp、616 bp、376 bp三条带，而R184S突变时，突变纯合子被酶切成464 bp、369 bp和159 bp三个片断，野生型纯合子为833 bp和159 bp两条带，杂合子为833 bp、464 bp、369 bp和159 bp四条带。

    3  讨论

    由于目前认为在丙戊酸钠的UGT代谢中，UGT1A6起主要作用，而CYP2C9基因多态性与丙戊酸钠肝毒性产物的产生具有密切关系，所以我们首先选择这两个位点进行研究。

    目前CYP2C9共发现并证实有13个SNPs，而目前的研究热点集中在CYP2C9*2［14］和 CYP2C9*3［15］。CYP2C9*4目前只在亚洲人有发现，而在白种人、非洲裔美国人并无发现，突变频率为0.02［16］。CYP2C9*5和CYP2C9*6在非洲裔美国人发现，突变频率为0.017［17］和0.006［18］。Blasidell等通过CYP2C9*12发现了变异体并命名为CYP2C9*7，其频率在非洲人群中从0.006到0.03。CYP2C9*8、CYP2C9*11 和CYP2C9*12目前已经实验证明，与野生型CYP2C9*1相比，在体外会改变其代谢活性［19］。CYP2C9*13是在人群中发现，突变频率为0.01，并认为能够减低CYP2C9的活性［20］。CYP2C9引起氨基酸改变的SNPs均可影响其酶的代谢活性，而其中研究较明确的为CYP2C9*2和CYP2C9*3，它们都可以引起酶活性的显著减低。而研究［6，7］发现CYP2C9*2和CYP2C9*3对代谢VPA以及生成4?ene?VPA的能力有很大区别，这与肝毒性有着直接的关系，因此对CYP2C9的分型就显得尤为重要。我们的研究结合以往的CYP2C9的基因分型的方法，建立了一个简单的分析CYP2C9*2的限制性片段长度多态性（RFLP）技术的方法，并成功设计了引物用来扩增包含CYP2C9*3、CYP2C9*4、CYP2C9*5的片断，并测序验证。

    目前UGT1A6发现了13个SNPs，其中包括6个新发现的突变。 UGT1A6*2、UGT1A6*3研究得较为明确，但认为其对药物代谢活性的影响，突变纯合子与杂合子有很大区别或产生完全不同的影响。因此对临床应用VPA的患者进行UGT1A6分型也非常重要，这样可以达到控制有效药物浓度，提高疗效，避免不良反应的目的。我们建立了简单易行的RFLP方法，期望验证后对指导临床用药有所帮助。

    如何设计出CYP2C9*3、CYP2C9*4、CYP2C9*5简便的酶切方法，争取一次抽血便可对4个SNPs进行分型，以及进一步对UGT1A9、UGT2B7进行研究，以探明VPA代谢酶基因突变程度与VPA血药浓度、中间代谢产物数量的相互关系，是今后的研究方向，这样才能更好地指导临床合理应用VPA，避免药物不良反应的发生。

【】
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