西红花质量评价研究
作者：朱友双，牛万刚，姚宝君
【摘要】 应用高效液相色谱和DAD检测器对上海、浙江、江苏大产地的药材进行了全面质量考察。本文可提供清晰的HPLC指纹图谱，药材总苷含量在23%～27%之间为优，指纹图谱相似度>0.9。西红花总苷的指纹图谱特征性及专属性强，可结合含量测定用于全面控制药材质量，确保每批产品的均一性。本文建立了西红花的指纹图谱检测标准，实验方法简便、准确、重复性好。
【关键词】 西红花；含量测定；指纹图谱
西红花为鸢尾科植物番红花（Crocus sativus L.）的干燥柱头，又名藏红花，被誉为“植物黄金”。具有活血化瘀，散郁开结，治忧思郁结，胸膈痞闷，吐血，伤寒发狂，惊怖恍惚，妇女经闭，产后瘀血腹痛［1］。本品在上依靠进口，见到的样品有外表加油、掺假、含量低现象存在。现在我国已引种栽培成功，质量优于进口品，每年并有相当数量的西红花药材出口［2］。目前国内已成功开发了西红花总苷片等药物，扩大了内需，因此迫切需要建立一套方便、可行、快速的质量鉴别方法，以便满足化生产的需要。
本实验对我国三大产地西红花药材应用色谱法—薄层色谱、高效液相色谱和紫外-可见分光光度法进行方法学研究。HPLC指纹图谱首次采用中药质量指纹图谱全谱图相似性方法，以指纹图谱和指标成分相结合的方法建立了西红花质量控制标准。
本文领会了国家药品监督管理局于2002年4月在上海召开的全国中药注射剂指纹图谱工作会议上的精神。通过建立中药材指纹图谱，可以促进同品种中成药各生产工艺的统一、规范和优化，稳定产品质量，提高质量标准的可控性，通过现代手段让世界了解中药，让中药走向世界。
1 仪器、试剂与试药
1.1 仪器 UV762双光束紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。LC-10Atvp岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司）。
1.2 试剂 甲醇（色谱纯，杭州汇普化工仪器有限公司）；磷酸二氢铵（分析纯，四川林辰实业集团有限公司）；三蒸水。
1.3 对照品 西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、西红花苷-Ⅲ、西红花苷-Ⅳ。
1.4 药材来源 见表1。表1 西红花药材来源
1.5 药材重量 见表2。表2 药材重量
2 西红花药材质量分析
2.1 紫外-可见分光光度法测定西红花药材总苷含量
2.1.1 样品液、标准液及供试液的制备
2.1.1.1 样品液 分别称取十个批号的药材一定量研成细粉，取60mg精密称定，70℃加甲醇索氏提取至溶液无色，冷却，甲醇定容至100ml容量瓶。
2.1.1.2 标准液 取西红花苷-Ⅰ对照品用甲醇制成0.02mg/ml标准液。
2.1.1.3 供试液 分别精密吸取上述样品液各1ml，甲醇稀释，定容至20ml。
2.2 测定波长的选择 西红花紫外-可见测吸收曲线，分在λmax（432±2）nm及（458±2）nm处有最大吸收。
2.3 西红花药材总苷含量测定 取十个批号药材供试液。以西红花苷-Ⅰ为基准物，433nm处测定吸收度。见表3。表3 西红花药材总苷含量
2.4 HPLC指纹图谱
2.4.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS2 250×4.6mm,5μm;流动相：甲醇-水（53：47）；甲醇-0.01mol/L磷酸二氢铵（48：52）；流速1ml/min;柱温30℃；检测波长440nm。
2.4.2 样品液及标准液制备
2.4.2.1 样品液 分别称取十个批号的药材研成细粉，精密称取60mg，甲醇索氏提取至无色，甲醇定容至100ml。
2.4.2.2 标准液 取西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和西红花苷-Ⅲ、西红花苷-Ⅳ混合物对照品用甲醇制成0.03mg/ml标准液。
2.4.3 指纹图谱技术对西红花药材质量评价
2.4.3.1 流动相的考察与优化 分别用甲醇-水（50：50）、甲醇-水（53：47）、甲醇-水（55：45）、甲醇-0.01mol/L磷酸二氢铵（50：50）、甲醇-0.01mol/L磷酸二氢铵（48：52）、甲醇-0.01mol/L磷酸二氢铵（45：55）六种体系进行洗脱，结果以甲醇-水（53：47）和甲醇-0.01mol/L磷酸二氢铵（48：52）体系得到的色谱峰形较好，尤其以甲醇-0.01mol/L磷酸二氢铵（48：52）峰形最好，分离度高，大部分得到基线分离，且较稳定。
2.4.3.2 参照峰的选择 西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ为指纹图谱中峰面积积分值较大、出峰时间较早、很稳定的两个峰，而且均可制备纯度>98%的对照品，西红花苷-Ⅲ和西红花苷-Ⅳ为指纹图谱中峰面积积分值较小、出峰时间较晚、两个峰较稳定。
2.4.3.3 指纹图谱的测定 精密吸取药材提取液2ml，甲醇定容量至10ml，精密吸取20μl，进样，记录60min的色谱图（见图1），以西红花苷-Ⅰ的保留时间和峰面积积分值为1，相对保留时间和峰面积积分值的比值。
2.4.4 实验方法考察
2.4.4.1 标准曲线制备 分别精密吸取西红花苷-Ⅰ标准液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25ml于1ml容量瓶中，西红花苷-Ⅱ标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml于2ml容量瓶中，西红花苷-Ⅲ标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml于2ml容量瓶中，西红花苷-Ⅳ标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml于2ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。各浓度进样20μl，按色谱条件测得峰面积积分值。以峰面积为纵坐标，进样量（μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线。见表4。表4 西红花苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准曲线制备
标准曲线的回归方程：西红花苷-Ⅰ：Y=45.443X+66.54,r=0.9996（n=5）,西红花苷-Ⅱ：Y=188.53X+425.37,r=0.9999（n=5），西红花苷-Ⅲ：Y=6.6685X-10.67,r=0.9998（n=5）,西红花苷-Ⅳ：Y=0.5635X-0.51,r=0.9996（n=5）。
2.4.4.2 各批次药材含量测定 见表5。表5 各批次药材含量测定
2.4.4.3 标准品及药材精密度实验 见表6。
标准液：取西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ对照品用甲醇制成0.02mg/ml标准液。表6 标准品精密度实验
2.4.4.4 稳定性实验 取同一批西红花药材，按2.1.1方法制备样品液，分别在0、2、4、6、8h检测指纹图谱，结果各峰峰面积积分值比值的RSD在0.38%～1.93%之间，相对保留时间差别在0.01～0.81min。
2.4.4.5 重现性实验 取同一批西红花药材，按2.1.1方法制备样品液，平行操作制备5份，分别检测指纹图谱，结果各峰峰面积积分值比值的RSD在3.17%～3.59%之间，相对保留时间差别在0.01～0.81min。
2.4.4.6 加样回收率实验 精密吸取批号20051102-03-1药材1ml，加入标准液西红花苷-Ⅰ0.5ml,至10ml容量瓶，甲醇稀释至刻度。进样20μl。见表7。表7 加样回收率实验
2.4.5 实验结果
2.4.5.1 指纹图谱 测得十批西红花药材的指纹图谱见图1，标定共有峰9个，其中包括作为参照峰的西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ色谱峰（3、4）。见图2。
2.4.5.2 共有指纹峰的保留时间和峰面积积分值 见表8。表8 共有指纹峰的保留时间和峰面积积分值
3 讨论
本文采用分光光度法测定药材总苷的含量，其精密度、稳定性和重现性均符合要求，因而作为药材质量初步考察标准，此法快速、简便、准确。
经过对10批西红花药材进行测定，制订了指纹图谱检测标准及相应的技术参数，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ性质稳定，可以作为定性、定量的参照物。
本文对流动相进行了优化， 选择了甲醇-0.01mol/L磷酸二氢铵（47:53）分离度较好，柱温的稳定使结果稳定性得到进一步保障。方法学考察实验结果证明该方法准确可靠，可用于西红花药材指纹图谱测定。
本文采用了计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件，提高了数据处理的精度，简化了繁琐的算法，但软件系统尚属摸索阶段，界面不够人性化，数据转换较麻烦，有待于进一步完善。
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1 江苏新医学院编.中药大词典，下册.上海：上海人民卫生出版社，1977，2671.
2 周素娣，周锦祥.国产西红花化学成分的研究.中草药，1997，28（12）：715-716.
