扶正软坚方对肺纤维化大鼠基质金属蛋白酶及其抑制因子表达的影响

                     作者：季旭明，赵启韬，孙敬昌，杨勇，朱庆均，刘恒，郑广娟   

【摘要】  目的 研究扶正软坚方对肺纤维化的干预作用及对MMP-9和TIMP-1表达的影响。方法 Wistar雄性大鼠60只，随机分为空白组、模型组、扶正软坚方大剂量组（简称“大剂量组”）、扶正软坚方小剂量组（简称“小剂量组”）。博莱霉素诱发大鼠肺纤维化建立模型，第28天时取肺组织行HE染色，观察病理形态学改变；运用免疫荧光方法，激光共聚焦显微镜检测肺组织MMP-9和TIMP-1的表达，并进行半定量分析。结果 与空白组比较，模型组MMP-9表达明显降低（P<0.05）,TIMP-1表达明显增强（P<0.01）；扶正软坚方各组能明显增强MMP-9的表达（P<0.05），明显降低TIMP-1的表达（P<0.01）。结论 扶正软坚方能减轻博来霉素诱导的大鼠肺纤维化，作用机制可能是通过增强MMP-9蛋白表达，抑制TIMP-1蛋白表达实现。

【关键词】  扶正软坚方；肺纤维化；基质金属蛋白酶-9；基质金属蛋白酶抑制剂-1

    【Abstract】  Objective  To study the effect of Fuzhengruanjian prescriptions on pulmonary fibrosis in rats and its possible mechanism.Methods  Sixty male Wistar rats were randomly divided into four groups: normal group, model group, large-dose group and little-dose group. The rat model was induced by bleomycin. HE staining was detected and pathomorphology was observed. The level of MMP-9 and TIMP-1 were detected by immuno fluorescence technique and laser scanning confocal microscopy on 28th day after the treatment.Results  In model group rats, the expression of MMP-9 was significantly degraded and the expression of TIMP-1 was significantly upgraded compared with that of normal group（P<0.05）. Fuzhengruanjian prescriptions could significantly upgrade the expressions of MMP-9 and degrade the expressions of TIMP-1 in a dose-dependent way.Conclusion  Fuzhengruanjian prescriptions alleviated bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats, increasing the expression of MMP-9 and suppressing the expression of TIMP-1 should be the mechanisms.

    【Key words】  Fuzhengruanjian prescription；pulmonary fibrosis；matrix metalloproteinase-9；inhibitior of matrix metalloproteinase-1

    肺纤维化是多种病因引起的一种慢性炎症性间质性肺疾病，其主要病理改变为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和肺纤维化。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）与肺纤维化关系密切，TIMP-1在肺纤维化过程中高表达，成为肺纤维化的标志物之一。笔者以大鼠肺纤维化模型为研究对象，探讨扶正软坚方对肺纤维化的作用及对MMP-9和TIMP-1表达的影响，结果报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及分组  Wistar健康雄性大鼠60只，体重180～200g，购于山东中医药大学实验动物中心。实验大鼠随机分为空白组、模型组、扶正软坚方大剂量组，扶正软坚方小剂量组4个组别，每组15只动物。正常饲养7天开始实验。

    1.2  主要药物及试剂  扶正软坚方由黄芪、麦冬等组成，所用中药材均购自山东建联中药店。水煎醇沉至1g/ml浓度备用。博莱霉素，日本化药株式会社生产，批号：540100。小鼠抗大鼠MMP-9单克隆抗体、羊抗大鼠TIMP-1 单克隆抗体、兔抗羊FITC-IgG、羊抗小鼠FITC-IgG均购自北京中彬生物技术有限公司。

    1.3  肺纤维化模型制备  参照方法用博莱霉素复制大鼠肺纤维化模型［1］，腹腔注射水合氯醛（300mg/kg）麻醉大鼠，仰卧固定，常规消毒，颈正中切开皮肤，钝性分离气管，于气管软骨环间隙用1ml注射器缓慢注入博莱霉素（5mg/kg）0.2～0.3ml，立即将大鼠直立旋转，使肺内药物分布均匀，空白组以同样方法气管内注入等量生理盐水。

    1.4  给药方法  于造模后第2天开始用药，大剂量组按照 24g/（kg·d），小剂量组按照12g/（kg·d），空白组、模型组灌服生理盐水，各组蒸馏水稀释等体积灌胃，每天1次，给药至实验第28天。每周复查动物体重以调整给药剂量。

    1.5  指标测定

    1.5.1  免疫荧光+激光共聚焦显微镜检测MMP-9和TIMP-1表达  采用免疫组织荧光法，抗体效价为1：100。石蜡切片脱蜡，正常血清封闭，一抗4℃过夜，0.1M PBS （pH7.4） 冲洗。二抗37℃孵育20min，0.1M PBS （pH7.4） 冲洗，Zeiss LSM510激光共聚焦显微镜检测。Zeiss LSM510 Image Examiner图像分析软件半定量分析图像相对荧光强度，蛋白表达量以相对荧光强度表示。

    1.5.2  肺组织病检查  取肺组织用甲醛固定，7天后进行包埋、切片，病理切片按常规方法进行HE染色。

    1.6  统计学方法  实验数据应用SPSS10.5统计软件处理，数据用x±s 表示。

    2  结果

    2.1  扶正软坚方对肺纤维化大鼠肺组织MMP-9和TIMP-1表达的影响  与空白组比较，模型组MMP-9表达明显降低（P<0.05）, TIMP-1表达明显增强（P<0.01），差异有显著性；扶正软坚方能明显增强MMP-9的表达（P<0.05），明显降低TIMP-1的表达 （P<0.05），差异有显著性。见表1。

    2.2  病理组织学检测

    2.2.1  肉眼观察  空白组双肺呈粉红色，表面光滑。模型组第28天双肺体积缩小，硬度增加。扶正软坚大、小剂量组肺表面颜色略暗，硬度低于模型组，双肺体积缩小较模型组轻，其中以大剂量组硬化程度最轻。表1  扶正软坚方对肺纤维化大鼠肺组织MMP-9 和TIMP-1表达的影响 （略）注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01

    2.2.2  光镜观察  正常组大鼠的肺支气管、终末性细支气管结构正常。模型组表现为肺泡壁成纤维细胞的增生，Ⅱ型上皮细胞增生，伴有大量胶原沉积；肺组织呈蜂窝状，局部肺实变。中药大、小剂量组第28天纤维化病灶较模型组减少，纤维化程度较轻，其中以大剂量组病变减轻程度最为明显。3  讨论

    在中医传统著述中，没有与肺间质纤维化完全相应的病名。根据本病的临床表现，一般将其列入“咳嗽”、“肺胀”或“短气”等门中。认为其病机多属本虚标实，肺脾气阴亏虚为本，痰浊、瘀血、热毒为标，治当益气活血，化痰散结，兼以清泻肺热。以此治法处方组成扶正软坚方，方中黄芪补脾益肺，白术健脾益气，当归活血化瘀，昆布化痰软坚，黄芩清泻肺热，麦冬滋补肺阴，诸药相合，共奏益气活血，化痰散结，清泻肺热之效。且临床研究发现以上诸药单味制剂或配于复方中对肺间质纤维化有实验性或临床性作用［5］。

    肺纤维化的主要病理表现为成纤维细胞异常增殖和细胞外基质（ECM）过度沉积，MMP-9/TIMP-1间的失衡导致ECM的代谢失衡。MMP-9属于Ⅳ型胶原酶基质金属蛋白酶（即明胶酶），在ECM的降解过程中发挥关键作用，TIMP-1在组织中能结合除MMP-14、MMP-19 以外的所有MMP，特异性抑制MMP-9，使其活性减弱，抑制其对ECM的降解；同时还能以非共价键形式与明胶酶原结合，从而抑制明胶酶原的自活化［2］。李圣青等［3］发现肺纤维化后期MMP-9水平下降，TIMP-1上升。万兵等［4］观察到在博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型中，MMP-9表达降低，TIMP-1表达升高。笔者运用免疫荧光技术，激光共聚焦显微镜检测MMP-9和TIMP-1表达，结果表明，肺纤维化模型中MMP-9蛋白表达水平下降，TIMP-1蛋白表达水平上升。扶正软坚方能明显增强肺纤维化模型动物MMP-9蛋白表达，明显降低TIMP-1蛋白表达。这与以上研究结果相符。说明扶正软坚方能够阻止肺纤维化的进一步，其作用机制可能与上调MMP-9表达，抑制TIMP-1的表达，改善MMP-9/TIMP-1间的失衡，恢复ECM的合成和降解的动态平衡有关。因此，扶正软坚方是防治肺纤维化的理想中药复方。

【】
  1 王昌明，何庆忠，张瑞祥.丹参酮对鼠肺纤维化过程中组织学变化的影响.中华结核和呼吸杂志，1994,（5）：308.

2 Oggionni T,Morbini P,Inghilleri S,et al.Time course of matrix metalloproteases and tissue inhibitors in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.Eur J Histochem,2006,50（4）:317-325.

3 李圣青，张坚，黎志东，等.小鼠肺纤维化模型中基质金属蛋白酶-9及其抑制剂表达水平的变化.细胞与分子免疫学杂志，2004,20（6）：723-726.

4 万兵，郑金旭，严玉兰，等.尿激酶对肺纤维化干预作用及对MMP-9和TIMP-1的影响.江苏大学学报（医学版），2007,17（5）：400-402.

5 唐德才，王全权，陈海林，等.中药抗肺纤维化的研究近况.时珍国医国药，2006,17（3）：3-5.