药物体内与体外研究评价方法及其相互关系
关键词：生物药剂学分类系统 溶出度 生物利用度 生物等效性 体内体外相关性
论文摘要 ：目的：综述药物体内-体外研究评价方法及其相互关系；方法：分析评述国内国外相关；结果：通过综述国内外溶出度研究的基本方法和生物利用度的评价方法可知,研究某个药物制剂的体内-体外相关性的目的，在于建立一个可以说明生物利用度的体外质量标准，和用作制剂批量生产时的质控指标；结论：对于具有良好体内-体外相关性的药物，通过测定体外溶出度可以预测药物的体内生物利用度.
KEY WORDS: Biopharmaceutical classification system; dissolution ; bioavailability; bioequivalence; in vivo-in vitro relationship
ABSTRACT OBJECTIVE: To summarize the research and evaluation methods between in vivo and in vitro of drugs and their relationships; METHODS: To analyze the domestic and overseas relative literatures; RESULTS: Known by summarizing the basic research and evaluation methods of dissolution and bioavailability/bioequivalence, the aim of researching the IVIVC is to set up the in-vitro quality standard which can illustrate the bioavailability and the QC index between batch and batch in production; CONCLUSION: The dissolution results of drugs can predict it’s bioavailability if the relationship between in-vivo data and in-vitro metric is fine.
1、前言
众所周知，口服或局部用药的制剂，其活性成分的吸收程度受多种因素的影响，在这些内在因素中，已知影响吸收的因素有制剂工艺、药物粒径、晶型或多晶型，处方中的赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、包衣材料、溶剂和混悬剂等。在制剂开发中为了缩短科研开发时间优化处方，通常会通过对体内与体外试验获得的数据进行分析，研究它们之间的关系。体内外相关性如果很好，那么体外溶出度的数据就可以较好地反应其体内的吸收行为。通过体内-体外相关性（In-vivo in-vitro Correlation或In-vivo in-vitro Relationship，IVIVC或IVIVR）研究实质就是想建立评价体内的体外方法，为了使制剂开发者利用最少的人体试验获得的试验结果得到最佳的制剂，同时最终达到应用体外溶出度的试验数据代替人体生物等效性试验的研究。
早在上个世纪70-80年代，体内体外相关性(IVIVC或IVIVR)的基本定义已经被建立。国际药学联合会、美国药典委员会和美国FDA和欧洲医药评价署等均对IVIVC的定义进行了提议。FDA定义IVIVC作为具有可预期的数学模型，描述了体外释放的程度和速率与体内相应的应答之间的关系，如血药浓度、药物体内吸收量。IVIVC是将药物剂型在体外的变化情况与其在体内的生物药剂学一药动学变化情况关联起来，它是体外溶出度和体内生物利用度参数的函数。研究某个药物制剂的体内体外相关性的目的是为了建立一个可以说明或建立药物生物利用度的体外质量标准，用于制剂批量生产时的质控指标。在实际工作中，通过测定体外溶出度来预测难溶性药物的体内生物利用度，进而筛选制剂处方和控制其质量具有重要的意义[8]。本文就体外溶出度测定和体内生物利用度等应用方法加以综述。
2、生物药剂学分类系统（Biopharmaceutical Classification System，BCS）
为了更好的理解溶出度与生物利用度的关系，先介绍一下什么是生物药剂学分类系统。生物药剂学分类系统(Amidon 1995)是根据药物的水溶性和膜通透性来划分的药物类型系统。药物制剂的溶解性是以药物的最高剂量测定的。在pH1.0～7.5范围（欧洲医药评价署规定的范围是pH1.0～6.8），37±0.5℃，药物的最高剂量可溶解在不超过250ml水中，定义为高溶解性的药物，否则被定义为低溶解性的药物。药物的膜通透性是口服药物制剂与静脉注射参照剂量或肠灌注平衡剂量研究结果进行对比（肠灌注平衡剂量可采用人体肠灌注、动物在体或原位肠灌注、人或动物离体肠组织体外膜通透性试验、体外单层上皮细胞（如Coca-2细胞或TC-7细胞）膜通透性试验等实验方法进行测定。如果药物在肠道的吸收程度不少于90％，则药物被定义为高膜通透性。
速释制剂通常是指其在0．1N盐酸或模拟胃液、pH4.5的缓冲液、pH6.8缓冲液或模拟肠液中，使用药典规定方法进行测试，30分钟内溶出不低于标示量的85% 的药物。事实上在不同情况下，胃平均排空时间差异较大，在空腹情况下为15-20分钟。因此在0.1mol/l盐酸溶液中在温和实验条件下15分钟溶出85%的处方，可保守的认为其具有较好的生物利用度。但如果溶出慢于胃排空速度则建议在不同溶出介质条件下考察不同时间点的溶出度情况。对于BCS中的第二类药物来说，药物的溶解度是药物吸收的限速因素，需要在不同溶出介质中考察其溶出情况；对于BCS中的第三类药物来说，药物的膜渗透性是其吸收的限速因素，其依赖于药物的溶出和肠转运的相对速率；对于BCS中的第四类药物来说，由于其低溶解性和低渗透性，其存在明显的吸收问题。
根据药物的水溶性和膜通透性，BCS将药物分为四类，其分类方法见表1；各分类中所包含的药物实例见表2。
表1、生物药剂学分类系统分类表
高溶解性 | 低溶解性 | |
高渗透性 | 第一类 | 第二类 |
低渗透性 | 第三类 | 第四类 |
表2、生物药剂学分类系统中各分类的代表药物表[10]
高溶解性 | 低溶解性 | ||||||
高渗透性 | 第一类 阿巴卡韦 阿昔洛韦 安替比林 卡托普利 普萘洛尔 | 环磷酰胺 齐多夫定 依那普利 地尔硫卓 米索前列醇 罗格列酮 | 左氧氟沙星 利多卡因 洛美沙星 美托洛尔 咪达唑仑 硝苯低平等 | 洛伐他汀 甲苯达唑 利托纳韦 红霉素 胺碘酮 地高辛 | 氟比洛芬 格列吡嗪 格列本脲 吲哚美辛 伊曲康唑 兰索拉唑 | 萘普生 螺内酯 酮康唑 华法林 布洛芬 达那唑等 | |
低渗透性 | 第三类 阿昔洛韦 阿米洛利 阿莫西林 阿替洛尔 西咪替丁 缬沙坦 | 法莫替丁 非索非那定 更昔洛韦 西替利嗪 青霉素类 普伐他汀 纳多洛尔 | 甲氨蝶呤 氯唑西林 环丙沙星 氢氯噻嗪 赖诺普利 头孢唑林 雷尼替丁等 | 第四类 两性霉素 B 氯噻酮 氯噻嗪 粘菌素 氨甲喋呤 新霉素 | 环丙沙星 呋塞米 氢氯噻嗪 甲苯达唑等 | ||
BCS的建立是在大量的体内体外实验数据的基础上的，对药物的研究开发中很具有一定的指导意义。从BCS的分类依据上可以看出体内与体外的试验结果并不一定存在因果关系，也就是说体外溶出行为较好，不能代表体内吸收就好，反之亦然。基于所获数据，FDA定义了描述体内外联系的三种水平模式，对其评价分析方法进行了说明。基于此三种水平模式，在IVIVC评价中用到的各种参数如表3。
表3、IVIVC评价参数对比表 [5][6][7][8]
水平 | 体外 | 体内 |
A | 溶出曲线 | 吸收曲线 |
B | 统计距MDT | 统计距 MRT MAT 等 |
C | 崩解时间，T10% 、T50% T90%， 溶出速率，溶出程度 | Cmax Tmax T10% 、T50% T90%，AUC |
水平A模型所描述的体内体外相关性通常是一种线性关系，体现的是体外溶出速率与体内吸收速率的点对点的关系。为了获得体内-体外点对点的联系，通常在进行体内试验的时候要求受试者空腹，以期能获得较为准确的体内吸收数据，描绘体内的吸收过程；体内数据依赖于血药浓度曲线，不同给药途径具有不同的吸收现象，血药浓度曲线上能反映药物进入血液的程度和速率，而这些又依赖于所服制剂的剂型、活性成分的性质及其药物在不同实验个体间的差异。因此仅仅依赖体外的释放行为并不能代表实际的体内的吸收行为，因为体内环境复杂。与体内研究结果比较，则显示出体外的溶出行为缺少一定权威性。
水平B模型描述了应用统计矩分析的数学原理，建立体外释放的平均时间与体内平均滞留时间的关系，但是应用此种分析相关性的方法并不能真实的反应体内的血药浓度水平曲线，因为大量的不同的体内的血药浓度水平曲线将产生相同的平均滞留时间值。
水平C模型对IVIVC的建立是在体外溶出参数与体内药代参数之间的单点联系，例如t50%和一定时间的溶出百分量与AUC、Cmax和Tmax之间的关系。但此种分析方式不能描绘出血药浓度-时间曲线的整体轮廓。在实际操作中，通常依据试验情况进行选择或联合应用进行分析。
上文对评价体内体外相关性的方法进行了简单介绍，接下来将在生物利用度/生物等效性的意义、试验方法等及溶出度的意义、试验装置和溶出介质等方面作详细介绍。
3、生物利用度/生物等效性(Bioavailability/Bioequivalence，BA/BE)
生物利用度是指剂型中的药物被吸收进血液的速率和程度。生物等效性是指一种药物的不同制剂在相同的试验条件下，给以相同的剂量，其吸收的速率和程度没有明显的差异。生物利用度是保证药品内在质量的重要指标。而生物等效性则是保证含同一药物的不同制剂质量一致性的主要依据。生物利用度和生物等效性概念虽不完全相同，但试验方法是一样的，都是为了控制药品质量，保证药品的有效性和安全性。
3.1进行BA/BE研究的意义
药物制剂要产生最佳疗效，其药物活性成分应当在预期时间段内释放吸收并被转运到作用部位达到预期的有效浓度。大多数药物是进入血液循环后产生全身作用，但是作用部位的药物浓度和血液中药物浓度之间存在一定的比例关系，也就是由于这种关系的存在，因此实验中可以通过测定血液循环中的药物浓度来获得反映药物体内吸收程度和速率的主要药代动力学参数，间接预测药物制剂的临床效果，以评价制剂的质量。生物利用度是反映药物活性成分吸收进入体内的程度和速率的指标，尤其是在含有相同活性成分的仿制产品要替代它的原创制剂进入临床使用的时候，生物利用度的测定显得至关重要。鉴于药物浓度和治疗效果相关，对于同一受试者，相同的血药浓度-时间曲线意味着在作用部位能达到相同的药物浓度，并产生相同的疗效，那么就可以药代动力学参数作为替代的终点指标来建立生物等效性。BA /BE 研究已经成为评价制剂质量的重要手段。
3.2研究BA/BE的方法
BE 研究是在试验制剂和参比制剂生物利用度比较基础上建立的等效性，BA 研究多数也是比较性研究，两者的研究方法与步骤基本一致，只是研究目的不同，因此在某些设计和评价上有一些不同，目前推荐的BA/BE研究方法包括体内和体外的方法。按方法的优先考虑程度从高到低排列：药代动力学研究方法、药效动力学研究方法、临床比较试验方法、体外研究方法。具体如下：
3.2.1 药代动力学研究
所谓药代动力学研究即采用人体生物利用度比较研究的方法。通过测量不同时间点的生物样本（如全血、血浆和血清或尿液）中药物浓度，获得药物浓度-时间曲线（Drug Concentration-Time curve）来反映药物从制剂中释放吸收到体循环中的动态过程。并经过适当的数据分析处理，得出与吸收程度和速率有关的药代动力学参数如曲线下面积（AUC）、达峰浓度（Cmax）和达峰时间（Tmax）等，通过统计学比较以上参数，判断两制剂是否生物等效。
3.2.2药效动力学研究所谓药效动力学是研究药物对机体的作用,也就是药效和药物浓度的关系。对某些药物来说，在实际操作中无可行的药代动力学研究方法用于建立生物等效性研究时，例如无灵敏的血药浓度检测方法、浓度和效应之间不存在线性相关等，可以考虑用明确的可分级定量的人体药效学指标通过效应-时间曲（Effect-Time curve）与参比制剂比较来确定生物等效性。
3.2.3临床比较试验
当无适宜的药物浓度检测方法，也缺乏明确的药效学指标时，也可以通过以参比制剂为对照的临床比较试验，以综合的疗效终点指标来验证两制剂的等效性。如果对照的临床试验因为样本量不足或检测指标不灵敏而缺乏足够的把握度去检验差异，应尽量采用药代动力学研究方法。
3.2.4 体外研究
根据生物药剂学分类证明属于高溶解度，高渗透性，快速溶出的口服制剂即BCS分类系统中第一类药物的制剂,可以采用体外溶出度比较研究的方法验证生物等效，既可以获得生物豁免（Biowaiver），因为该类药物的溶出速率和程度与吸收速率和程度已经不是药物进入体内的限速步骤。当然在没有明确的数据证明其体内体外具有良好的相关性的前提下，不提倡用体外的方法来确定生物等效性，因为体外并不能完全代替体内行为。对于难溶性但高渗透性的药物（BCS分类中的第二类药物），如已建立良好的体内外相关关系，也可用体外溶出的研究来替代体内研究。由于体内具有复杂的酶系，因此对于易溶性但低渗透性的药物（BCS分类中的第三类药物）中的某些药物来说，用体外溶出的研究来替代体内研究的大门也为其敞开的。
4、溶出度
药物溶出度(dissolution rate)是指药物从片剂、胶囊剂或颗粒剂等固体制剂在规定的介质中溶出的速率和程度。由于药物的溶出直接影响药物在体内的吸收和利用，溶出度试验已成为评价制剂质量及生产工艺的指标之一。
4.1溶出度的意义
口服制剂的溶出度测定主要包括考察和验证方法学,保证此方法具有专属性,能够反映体内过程,达到体内体外相关。一般来讲,体外溶出度测定的目的是反映其体内的生理循环过程(吸收、分布、代谢和排除，ADME),在临床前和一期临床阶段溶出度的基本目的是建立一种方法为了清楚的建立体外药物释放和溶出的机理。在二和三期临床阶段溶出度测定的目的则主要在于提供一种监测方法来反映体内体外相关性,反映有关生物等效方面的信息。在上市批准后主要作为质量控制,以保证批与批之间的一致,反映的是生产工艺的可重复性。
通过溶出度测定结果既能反映产品的一致性又能反映其体内生物利用度当然是再好不过了,但对于药物制剂和分析工作者来说显然是可遇而不可求的。方面和权威部门仅对这些问题提供一些指导意见，在实际操作中还需要体内体外数据的支持。
4.2溶出度试验的目的
做溶出度试验的目的主要是想通过建立溶出度测定方法来反映药物在体内的释放特性,用体外释放模拟药物体内的释放行为，尤其是难溶性药物的体内释药行为。溶出度测定在药物研发过程中已经成为一种重要的工具,通过评价药物释放的速率和程度帮助开发评价处方,监测工艺的一致性和可重复性，通过体外溶出度测定结果调整处方工艺，最终建立合理的体内体外相关性评价方法。溶出度测定对于上市销售的产品也具有重要意义，通过测定货架期药物的溶出情况，则可以评价产品在货架期间的质量变化,据此反映到体内的行为，以监测其有效期。
4.3 药品溶出度测定装置
溶出度检查装置一般由模拟胃和检测装置两部分构成。模拟胃是一种程序控温的药物溶解装置，用以模拟人体胃中的环境，通常控制温度为37℃，酸度大小随进食与否和药物的性质的不同而作相应调整。目前科研工作者在努力建立能够模拟人口服药物后，药物在人体胃肠道的过程的体外反应模型，这项工作很值得期待。根据检测溶解装置的不同，溶出度检查方法有桨法（Paddle）、转篮法（Rotating Basket）、流通池法（Flow—Through Cel1）、往复筒法（Reciprocating Cylinder）、桨碟法（Paddle over Disk）、往复支架法（Reciprocating Holder）、转筒法(Rotating Cylinder)和小杯法(Mini Vessel)等。不同装置适用适用侧重点不同，具体内容如表4。
表4 溶出度测定装置、名称及其适用[27]
溶出装置 | 名称 | 适用 |
1 | 桨法 | 片剂胶囊剂 |
2 | 转篮法 | 片剂胶囊剂 |
3 | 流通池法 | 难溶性药物 |
4 | 往复筒法 | 片剂胶囊剂 |
5 | 桨碟法 | 半固体制剂和透皮制剂 |
6 | 往复支架法 | 透皮贴剂 |
7 | 转筒法 | 透皮贴剂 |
8 | 小杯法 | 片剂胶囊剂 |
美、英和日作为发达国家其溶出度测定的药典方法值得借鉴，而作为最大的中国家，在溶出度测定装置的选择上具有其自身特点。丁丽等[11]对四个国家的药典标准（《美国药典》30版，《英国药典》2005版，《日本药典》15版和《中国药典》2005版)中口服固体制剂的溶出度检测方法已进行比较详细的介绍。其中《中国药典》收载了小杯法用于活性成分含量低的药物制剂体外测定。正是因为一些药物具有高效，剂量低的特点，因此目前国外研究者[18]也在研究开发应用小杯桨法进行溶出度测定，这里指的小杯法不仅仅指是250ml容积的小杯，而是如100ml、50ml等更小的溶出杯测定法。开发小杯法还可以减少在研究难溶性药物时应用较为昂贵的与生物相关的溶出介质的量。将来小容量溶出杯及配套的桨或篮也将是溶出测定考察装置的补充。
4.4 溶出度测定的基本媒介
提高体外溶出度试验与体内生物利用度的相关性，及确立溶出度试验条件来有效地进行评价制剂质量是研究的重点之一。溶出度试验装置中的转篮、桨板及转速可用于模拟人体胃部和小肠的蠕动。目前国际上通常采用以下4种溶出介质来模拟：(1)0.1mol/L盐酸溶液，我国目前通常采用取9ml盐酸以蒸馏水稀释到1000m1方法配制。国外目前倾向于氯化钠2.0g，加水适量溶解，加盐酸7ml，再加水稀释至1000ml的方法配制；(2) pH4.5醋酸盐缓冲液；(3) pH6.8磷酸盐缓冲液；（4）水。
一般口服固体药物可选用上述溶出介质，但对于水溶性差的药物来说可能不合适，实际实验操作中可加入不同量的表面活性剂、醇类、胆酸、胆酸盐和卵磷脂配成不同浓度的溶出介质来增加这些口服难溶性药物的体外溶出度。因为，在体外溶出介质中加入一定浓度的表面活性剂或增溶剂等附加剂，可改善难溶性药物在水溶性介质中的浸润状态，更好地模拟体内过程。为了更接近人体胃肠环境，还可以用与生物相关的溶出介质（Biorelevant dissolution medias）,因为其造价较高配制复杂，因此应用范围还不是很广泛，这些溶出介质有FaSSIF、 FeSSIF、 SGF和 FaSSGF，其pH值分别为：pH6.5、pH5.0、pH1.2 和pH1.8。
5、体内-体外的相互关系
本文分别从BCS、溶出度研究方面和BA/BE研究评价方法方面作了一些介绍。溶出度测定在药物研发过程中已经成为一种重要的工具，应用体外溶出度测定反映其体内的生理循环过程，模拟药物体内的释放行为，作为质量控制以保证批与批之间的一致，其反映的是生产工艺的可重复性，这些作用已成为体外溶出度测定的重要价值体现。如叶冬梅等[16]研究比较了不同厂家的别嘌呤醇片的溶出度，结果A、B两厂家溶出度45min 结果符合规定，C厂家则不符合规定，三厂家的溶出参数T50、Td、m有极显著差异。说明体外溶出度试验对控制药物质量具有重要作用。
通过溶出度测定结果既能反映产品的一致性又能反映其体内生物利用度当然是再好不过了，但对于药物制剂和分析工作者来说显然是需要大量体内-体外试验去验证的。水难溶性药物制剂是药典规定需要进行生物利用度和溶出度测定的药物类型之一，因此，在实际工作中，对于具有良好体内-体外相关性的药物，通过测定体外溶出度来预测难溶性药物的体内生物利用度，进而筛选制剂处方和控制其质量具有重要的意义，例如BCS分类中的第一类药物。药物的生物利用度试验操作过程较溶出度试验复杂，药物制剂的活性成分只有在预期时间段内释放吸收并被转运到作用部位达到预期的有效浓度才能产生最佳疗效。但是大部分药物体外评价还不能代替其体内研究试验，如王萍等[17]研究比较了四厂家的卡马西平片溶出度和生物利用度结果。从体外实验看出，不同药厂及同厂不同批号卡马西平片的含量、崩解时限均符合规定，但各样品间的崩解时限及溶出度差异较大(P<0.01)，且C厂的卡马西平片溶出度未达中国药典规定要求；从体内吸收实验看出，不但不同厂卡马西平片的主要药代动力学参数Tmax、Cmax 和AUC有显著的差异(P<0.01)，而同一厂家B厂的2个批号样品的体外质量虽然均符合药典的要求，但其生物利用度却存在着非常显著的差异。由此可以看出，在某些品种中不同厂家的产品质量--不论在体内还是在体外都可能存在较大差异，即使是同厂家不同批号的产品的质量问题也不能忽视，更加说明体内体外研究的重要性。
体内-体外相关性就是将药物剂型在体外的变化情况与其在体内的生物药剂学一药动学变化情况关联起来，它是体外溶出度和体内生物利用度参数的函数。也就是说研究某个药物制剂的体内-体外相关性的目的，在于建立一个可以说明生物利用度的体外质量标准，和用作制剂批量生产时的质控指标。即便当前由于体外溶出度测定与体内生物利用度评价存在一定的问题，但本作者相信随之科技的进步，体外溶出度测定试验在不久的将来在模拟体内行为方面会发挥更大的作用。
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