SPE?RP?HPLC法测定女贞子药材中齐墩果酸、熊果酸的含量
【摘要】 目的 为女贞子药材的质量评价提供依据。方法 以固相萃取（SPE）进行样品供试液的前处理，采用RP?HPLC法，分别测定齐墩果酸与熊果酸的含量，色谱柱：Kromasil KR100?5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：［乙腈?甲醇（体积比1∶1）?水（体积比90∶10）］；流速：0.8 mL/min；检测波长：210 nm；柱温25 ℃；进样量：2 μL。结果 样品中齐墩果酸与熊果酸得到较好的分离；齐墩果酸在0.108～3.24 μg的范围内、熊果酸在0.060～1.800 μg范围内，与峰面积呈良好的线性关系；平均回收率分别为100.50％、98.05％；11批次样品中齐墩果酸的含量为0.639～1.340 mg/g，熊果酸的含量为0.168～0.377 mg/g。结论 采用SPE进行供试品溶液前处理，能够有效消除女贞子药材中杂质成分对末段吸收波长的干扰，所建立的方法具有简便、稳定、可重复的特点，可用于女贞子药材的质量控制。
【关键词】 女贞子；齐墩果酸；熊果酸；含量测定；固相萃取；HPLC
Determination of oleanolic acid and ursolic acid in Fructus ligutric lucidi by RP?HPLC
JIANG Tie?jun
(Guangzhou Che Li Ji Pharmaceutical Factory,Guangzhou 510290,China)
Abstract:Objective To determine the contents of oleanolic acid and ursolic acid in Fructus ligustric lucidi for the quality control of Fructus ligustric lucidi. Methods and Results Oleanolic acid and ursolic acid were separated completely under selected choromatography condition.The content range of oleanolic acid in eleven batches of samples was 6.39-13.40（mg/g）,and the content range of ursolic acid was 1.68-3.77（mg/g）.Conclusion This method is simple,stable,accurate and reliable for the quality control of Fructus ligutric lucidi.
Keywords:Fructus ligutric lucidi; oleanolic acid; ursolic acid; HPLC
女贞子为常用中药，具有滋补肝肾、明目乌发的功效，用于眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白、目暗不明等证［1］724。女贞子中主要含有三萜类成分，其中齐墩果酸为主要的代表性成分，此外尚含有熊果酸等。有关女贞子药材及含女贞子中药复方制剂的质量多以齐墩果酸的含量作为评价指标［1］728。药典2005年版（一部）［3］收载女贞子的含量测定方法为薄层扫描法测定齐墩果酸的含量。近年来，亦有采用HPLC?UV方法［4］以及HPLC?ELSD方法［5］测定本品中两成分的含量，但由于HPLC?UV测定波长在末端吸收，不能有效排除供试品中的杂质对测定结果准确度的影响；而ELSD检测器还未能普遍应用。因此上述方法都有一定的局限性。
固相萃取（SPE）是一种新兴的样品前处理技术，近年来已经应用于中药含量测定方法研究［6-8］，但还未见有将此方法应用于女贞子的含量测定中。本文报道采用此技术进行女贞子药材样品的前处理，结合反相高效液相色谱法，消除了样品中杂质对齐墩果酸、熊果酸在紫外末端测定的干扰，使样品中齐墩果酸与熊果酸在同一色谱条件下较好地得到了分离，并进行了多批次样品的含量比较，以期为女贞子药材的质量评价提供更稳定可靠的方法。
1 仪器与试药
HP1100 Series高效液相色谱仪（美国Agilent），二极管阵列检测器及HP Chem Station 4.0 色谱工作站； Millipore 纯净水发生器（Millipore Co. Ltd.,USA）；SUPELCLEAN固相萃取小柱（500 mg/3mL，美国SUPELCO公司）。
齐墩果酸（oleanolic acid）、熊果酸（urosolic acid）对照品及女贞子对照药材（批号1041－9701）购自中国药品生物制品检定所，女贞子药材测试品来源见表1。液相色谱纯试剂为Merck公司产品，其余试剂均为国产分析纯。
表1 女贞子药材样品来源（略）
Tab.1 Samples of Fructus ligutric lucidi
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性
以Kromasil KR100?5 C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱；以［乙腈?甲醇（体积比1∶1）?水（体积比90∶10）］为流动相；流速为0.8 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长为210 nm；进样量为5 μL。理论塔板数按齐墩果酸峰应不低于5 000，按熊果酸峰计算应不低于4 000，二者的分离度为1.47，齐墩果酸的拖尾因子为1.02，熊果酸的拖尾因子为0.99。对照品和样品的色谱图见图1。
图1 对照品（A）及女贞子药材（B）HPLC色谱图（略）
Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances（A）and sample of Fructus ligutric lucidi
2.2 对照品溶液制备
精密称取齐墩果酸、熊果酸对照品适量，加甲醇溶解并定容，分别制成质量浓度为216 μg/mL，120 μg/mL的溶液，备用。精密吸取上述对照品溶液各1 mL，置2 mL量瓶中，充分混和，制成对照品混合溶液，备用。
2.3 线性关系考察
分别精密吸取上述对照品混合溶液1、2、4、6、8、10、20、30 μL，按“2.1”项色谱条件进样测定，以峰面积（A）对照品质量（m）进行线性回归，回归方程分别为：齐墩果酸A=0.5954m+6.0525，r=0.9999，线性范围0.108～3.24 μg；熊果酸A=0.7213m+2.7388，r=0.9999，线性范围：0.060～1.800 μg。
2.4 供试品溶液制备
取女贞子药材粉末约1.0 g，精密称定，加三氯甲烷20 mL，称重，水浴回流提取2次，每次0.5 h，冷却后称重，加溶剂补足重量，滤过，合并滤液，水浴蒸干溶剂，残渣以三氯甲烷5 mL溶解，加于固相萃取小柱上，收集洗脱液于10 mL量瓶中，继续加4 mL洗脱，合并至量瓶中，加三氯甲烷至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
2.5 稳定性试验
精密吸取对照品混合溶液5 μL，分别于0、1、2、4、8、12、24 h测定，结果齐墩果酸、熊果酸的平均峰面积分别为776.4、248.5，RSD分别为1.22％、1.43％。
2.6 精密度试验
精密吸取对照品混合溶液5 μL，重复进样6次，结果齐墩果酸、熊果酸的平均峰面积分别为767.9、246.4，RSD分别为0.72％、1.09％。
2.7 重复性试验
取同一批次供试品9份，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，吸取2 μL进样，进行测定，结果齐墩果酸、熊果酸的平均质量分数分别为0.93％（n=9）、0.25％（n=9），RSD分别为1.51％、2.56％。
2.8 回收率试验
取6份同一已知齐墩果酸和熊果酸含量的女贞子药材0.5 g,精密称定，分别准确加入齐墩果酸、熊果酸对照品各适量，余同“2.4”项下操作，进样2 μL，测定峰面积，回收率，结果齐墩果酸、熊果酸的平均回收率及RSD分别为100.50%、98.05%和2.36%、2.6%，见表2、3。
2.9 样品含量测定
取11批样品各1 g，依法制成供试品溶液，精密吸取2 μL，依选定的色谱条件进样测定，计算含量，结果见表4。
表2 齐墩果酸加样回收率试验（略）
Tab.2 Recovery results of oleanolic acid
表3 熊果酸加样回收率试验（略）
Tab.3 Recovery results of ursolic acid
表4 女贞子药材齐墩果酸、熊果酸含量测定结果（略）
Tab.4 Determination results of oleanolic acid and ursolic acid
3 讨论
3.1 三萜类成分为女贞子中的主要成分，齐墩果酸为其中的代表性成分。本文采用硅胶作为固相萃取的填料，能够有效吸附女贞子提取液中的杂质，从而保证了样品在210 nm下受到的干扰最小。
3.2 供试品制备过程中，SPE小柱洗脱后收集三氯甲烷溶液蒸干，残渣若用甲醇溶解，结果残渣不能完全溶解，可能是由于三氯甲烷洗脱液中包含有少量不溶于甲醇的非极性物质；而且齐墩果酸、熊果酸含量比本文采用的样品处理方法的含量低约11%。而对照品加甲醇，则能够完全溶解。表明样品中的非极性杂质在用甲醇溶解时，由于其不溶于甲醇而包裹了部分齐墩果酸、熊果酸从而导致含量降低。另外，若用甲醇洗脱，由于甲醇的洗脱能力太强，将杂质一并洗脱，不能使SPE起到净化样品的作用。采用三氯甲烷洗脱既能有效洗脱齐墩果酸、熊果酸，又能减少杂质的干扰，因此最终决定采用三氯甲烷作为样品溶剂。
3.3 SPE小柱有100 mg/3 mL、500 mg/3 mL等不同的规格，在试验过程中发现100 mg/3 mL小柱不能完全吸附齐墩果酸和熊果酸，导致回收率偏低。而500 mg/3 mL则能够完全吸附。因此，在采用SPE方法进行样品前处理时，应考虑SPE小柱的吸附容量大小对含量测定的影响。
3.4 从测定的11批结果看，不同来源的女贞子药材中齐墩果酸差异为2.1倍；熊果酸的差异为2.2倍。表明不同来源的女贞子药材中二者的含量有一定的差异。
【】
［1］ 郑虎占,董泽宏,余靖.中药研究与应用(第一册)［M］.北京:学苑出版社,1997：
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