高效液相色谱法测定西司他丁钠的含量及有关物质

【摘要】  目的 建立HPLC测定西司他丁钠的含量和有关物质。方法 采用高效液相法色谱(HPLC法)，以C18柱(4.6mm×250mm，5μm)为分析柱，乙腈∶0.1mol/L磷酸铵(用磷酸调pH至6.8)(30∶70)为流动相，检测波长210nm，流速0.8ml/min，柱温50℃。结果 西司他丁钠在0.08～0.60mg/ml范围内与峰面积有良好的线性关系，平均回收率为100.2%(n=9)。西司他丁钠与相邻杂质峰完全分离，西司他丁钠的检测限为1.8ng，定量限为5.9ng。结论 该方法可靠、简便、准确。可作为西司他丁钠含量和有关物质的测定方法。

【关键词】  西司他丁钠； 高效液相色谱法； 有关物质

     ABSTRACT  Objective  To establish an HPLC method for the determination of the content and the related substances of cilastatin sodium.  Method  The column: C18(4.6mm×250mm, 5μm) was used, the mobile phase was acetonitrile and 0.1mol/L phosphate ammonium (adjust to pH6.8 with phosphoric acid) (30∶70), the detecting wavelength was 210nm, the flow rate was 0.8ml/min and the column temperature was 50℃. Results  The average recovery was 100.2% (n=9). Cilastatin sodiumn could be completely separated from other impurities. Limit of detection for cilastatin sodium was 1.8ng. Limit of quantitation for cilastatin sodium was 5.9ng.  Conclusion  The proposed HPLC method is reliable, convenient and accurate. The method can be used for determination of content and related substaces of cilastatin sodium.

    KEY WORDS  Cilastatin sodium;  Related substaces;  HPLC

      西司他丁钠(cilastatin sodium，CS)是一种很好的肾去氢肽酶I抑制剂，其本身不具有抗菌活性，对β?内酰胺酶也无抑制作用，它是碳青霉烯类药物亚胺培南(imipenen，IMP)的增效剂。IMP单独给药时，经肾小球过滤或分泌后，被近端肾小管上皮细胞刷状缘中的去氢肽酶I水解失活60%～95%，导致尿中活性药物浓度降低。CS能阻抑IMP进入肾小管上皮组织，减少IMP的排泄并保护IMP在肾中不被破坏，可防止因IMP引起的肾小管坏死，减轻药物的肾毒性，增加疗效。两者合用后西司他丁减少IMP被肾小管上皮细胞的去氢肽酶水解，可使IMP的AUC增加20%，在尿中回收的原形药物多达70%，所以在制剂时IMP/CS以等量配制［1］。

    IMP/CS适用于多种细菌的混合感染和需氧/厌氧菌的混合感染以及在尚未确定病原菌前的早期，近年广泛用于抗感染治疗，取得满意结果，已成为治疗严重感染的一线药物。

    对于原料CS的含量测定，国外药典采用电位滴定法［2］，国内未见报道。本研究建立HPLC法测定CS含量和有关物质，得到满意结果，现报道如下。

    1  仪器与试药

    岛津LC?2010A型高效液相色谱仪，Waters millipore真空泵，SB5200型超声波仪，F?13型酸度计，岛津MultiSpec?1501紫外分光光度计。

    CS原料3批(由某药厂提供；批号20044006、20044007和20044008)；CS对照品(纯度97.8%)由河北省药品检验所提供；乙腈为色谱纯，磷酸铵、磷酸二氢钾、盐酸、30%过氧化氢、氢氧化钠均为分析纯。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件

    色谱柱：Diamond C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈∶0.1mol/L磷酸铵(精密称取磷酸铵20.31mg，加1000ml水使溶解并稀释至刻度，用磷酸调至pH6.8)(30∶70)；流速0.8ml/min；检测波长210nm；柱温50℃；进样量20μl，结果见图1。

    1：西司他丁钠；  2、3：未知杂质

    图1    西司他丁钠HPLC有关物质图谱

    2.2  系统适用性

    (1)柱效与不对称度取CS对照品溶液进样，理论塔板数按CS峰为7070。

    (2)进样精密度试验  取CS对照品溶液连续进样5针，其峰面积的RSD为0.008%，表明系统精密度良好。

    2.3  专属性

    对CS对照品进行高温、氧化、强酸、强碱的破坏性试验，以研究其降解产物与主峰的分离情况。

    在选定的色谱条件下，取上述破坏后供试品溶液进样，结果主峰与各杂质峰获得有效分离，提示氧化和强酸破坏产生较大杂质，高温和强碱破坏总杂质量和杂质个数变化不大，表明CS在氧化、强酸条件下较不大稳定，强碱和高温对样品影响较小。

    2.4  准确度

    精密称取CS对照品及已知含量的样品各三份，分别置于100ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度，制成含量测定浓度的80%、100%和120%的溶液，摇匀，滤过，进样，结果低、中、高3个浓度的回收率(n=3)分别为100.1%(RSD=0.28%)、100.8%(RSD=1.24%)和99.8%(RSD=0.53%)；平均回收率为100.2%(n=9)(表1)，表明方法准确度良好。表1    回收率测定结果

    2.5  线性和范围

    精密称定CS对照品，置25ml容量瓶中，加水使溶解，加至刻度，分别制成0.0793、0.1586、0.3172、0.4758和0.6344mg/ml对照品溶液按“2.1”项色谱条件进行测定，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，结果在0.08～0.60mg/ml的浓度范围呈良好的线性，线性方程为：

    y=5.178×107x-1.981×105  r=0.9997

    2.6  方法精密度

    同一批样品，分别进样6次，依法测定含量，结果含量的RSD为0.08%，表明方法精密度良好。

    2.7  检测限和定量限

    以信噪比≈3时，注入仪器的量确定CS的检测限为1.8ng；以信噪比≈10时，确定CS的定量限为5.9ng。

    2.8  样品溶液的稳定性

    在同一批样品的溶液，在0、1、2、3、4和5h分别进样进行考察溶液的稳定性，测得峰面积的积分值，结果RSD为0.78%，表明在室温(25℃)条件下，溶液放置6h，其主峰面积没有变化，保留时间也基本没有变化。因此，CS溶液稳定性好。

    2.9  重复性试验

    分别平行制备6份CS供试品溶液。在上述色谱条件下，分别进样20μl，测得CS的含量。结果显示RSD为0.58%，说明本实验方法重复性好(表2)。

    2.10  有关物质的测定

    原料测定溶液的制备  精密称取CS 15mg，置25ml容量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml容量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

    测定方法  量取对照品20μl注入液相色谱仪中，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%，再分别精密量取上述各溶液20μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图至20min(表3)。

    表2    重复性测定结果表3    有关物质检测结果

    2.11  含量测定

    对照品溶液的制备  精密称定CS对照品适量，加水溶解并稀释成每1ml中约含CS 0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

    供试品溶液的制备  取本品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含0.3mg CS的溶液，作为供试品溶液。

    测定方法  取CS原料3批，按上述方法制被测定溶液，各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积CS含量，结果见表4。

    取CS原料3批(同上)，用电位滴定法进行试验，结果见表4。

    3  讨论

    (1)流动相的选择  CS的化学名为(Z)?7?［［(R)?2?氨基?2?羧乙基］硫］?2?［(S)?2，2?二甲基环丙烷甲酰氨基］?2?庚烯酸钠。由于分子结构中含叔胺结构，它易表4    含量测定结果与固定相表面残余硅醇基形成氢键，发生次级保留效应，导致拖尾，故应在流动相中加入适当的添加剂，以限制硅醇基团对CS分子的作用。本文选用季胺类离子对试剂磷酸铵。磷酸铵与CS为同种电荷，在本色谱系统中，一方面与溶剂间存在静电排斥力，另一方面作用于固定相表面，抑制溶剂的亲硅醇基团效应，达到改善对称性，提高柱效，缩短溶质保留时间。在本试验中曾用0.1mol/L的磷酸溶液，但是同样浓度下改善峰形的效果远不如磷酸铵。在流动相中加入较低浓度的磷酸调节pH至6.8，有助于保持峰形的对称性。在流动相的pH选择上，曾用pH5.5、pH6.0，、H6.5以及pH6.8但都不及pH6.8，在此条件下，主峰保留时间缩短，柱效明显增加。有机相选用30%的乙腈与磷酸铵混合，是用来加快CS的出峰时间，降低柱压，提高柱效，改善主峰与杂质峰的分离度。

    (2)检测波长的选择  取CS对照品适量，用水溶解并稀释至15μg/ml的溶液。在200～700nm波长范围内扫描，结果CS在此范围内无最大吸收波长，但考虑其边缘效应，同时考虑到其基线噪音的稳定性，故选择CS和杂质均有较高检测灵敏度作为测定波长。

    (3)柱温的选择  分别将柱温设为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃，结果显示柱温对分离影响不大，但升高柱温可使系统平衡时间缩短，基线稳定性明显改善，降低了流动相的粘度和柱压，缩短了保留时间，提高柱效，适当改善峰形，使试验结果重现性更好。

    (4)与电位滴定方法的比较  电位滴定法测定CS含量时，共有三个突跃点，计算采用第一和第三突跃之间的滴定数差值。但是它的第一个突跃很不显著，影响结果的判定，也影响测定准确度。采用高效液相色谱法，简单、快速且准确度高。

    致谢：本文的实验得到长治医学院2002级学生张文波和宋鑫鑫两位同学的大力协助。

【】
 ［1］ 张建民，冯玲玲，李勇，等. 抗菌药物增效剂［J］. 药师，2003，6(3)：172～173.

［2］ The United States Pharmacopoeial Convention Inc. The United States Pharmacopoeia XXVIII［S］. The Board of Trustees,2005:471～472.