叶下珠多酚类化合物的LC/MS分离鉴定
【摘要】 ［目的］分析叶下珠多酚化合物的组成，为质量标准制订提供依据。［方法］叶下珠药材，以50%乙醇提取，乙酸乙酯萃取，萃取液过微孔滤膜后，采用LC/MS对各成分分离鉴定。［结果］叶下珠多酚是以芸香苷、叶下珠素和鞣花酸为主的化合物，游离的没食子酸含量很少。［结论］单以没食子酸为质量指标不合理，而以芸香苷、叶下珠素和鞣花酸总量为指标更具合理性。
【关键词】 叶下珠 多酚类化合物 HPLC/MS
Abstract:［Objective］To present the basis for qualitative control by analyzing the components of polyphenols in Phyllantuus urinaria L.［Method］Raw material was extracted by 50% ethanol，then purified by acetic ethyl.The extract was injected into LC/MS after filtering with micro?membrane.［Result］The polyphenols mainly consisted of rutin，phyllansusiin，ellagic acid，etc，but less free gallic acid.［Conclusion］The total content of these compounds should be used for qualitative control instead of gallic acid.
Key words:Phyllantuus urinaria L.；Polyphenols；HPLC/MS
叶下珠为大戟科叶下珠属植物叶下珠Phyllantuus urinaria L.的干燥全草，又名珍珠草、夜合草、阴阳草，主要分布在长江中下游和南方诸省。叶下珠具有平肝清热、利水解毒等功效，主要小儿疳积、黄疸肝炎、肠炎痢疾等［1］。近来研究发现，叶下珠对乙肝患者具有明显疗效，因而成为研究的热点［2，3］。叶下珠成分复杂，含黄酮类、木脂素类、香豆素类、鞣质、有机酸等多种成分，有报道多酚化合物是其有效成分［4］。目前叶下珠有效成分多以没食子酸含量为质量检验标准［5］。由于多酚化合物有多种，以没食子酸为其有效成分指标是否具有合理性仍值得探讨。为了探讨合理的质量标准，本文采用HPLC/MS联用技术对叶下珠中多酚化合物进行了分离鉴定。
1 实验材料
1.1 药物与试剂
药材购自广东肇庆地区，经鉴定为大戟科叶下珠Phyllantuus urinaria L.的干燥全草。甲醇，磷酸，均为色谱纯；水为超纯水。
1.2 仪器
Agilent LC?MS系统。含真空脱气机、四元高压梯度泵、恒温自动进样器、二极管阵列检测器（DAD），ESI接口、LCQ Advantage质谱仪。色谱和质谱数据的采集和处理由Agilent数据工作站完成。
2 方法
2.1 供试液的制备
取20g药材粉末，加50%乙醇300ml超声30min，过滤，浓缩滤液到50ml，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩到30ml左右，浓缩液经0.45μm滤膜滤过，取此滤液作为供试液。
2.2 色谱条件及方法
色谱柱Agilent C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脱系统（表1）；流速：0.6ml/min；柱温30℃；检测波长270nm；进样量5μl；柱后分流0.4ml/min进质谱仪；MS同时记录总离子流（TIC）色谱图。m/z扫描范围：150～1200；电喷雾离子化（ESI），采用阴阳离子模式检测，MS/MS的轰击能约为30%。记录时间为60min。表1 流动相梯度（略）
3 结果
3.1 叶下珠多酚化合物的HPLC分离效果
通过HPLC分离，共获得9个色谱峰，各峰得到较好地分离（图1）。从其相对含量比较，主要多酚化合物集中在4，5，6，7，8峰，占总面积的84.22%（表2）。表2 叶下珠提取物中多酚化合物的相对含量（略）
3.2 叶下珠多酚化合物的质谱鉴定
叶下珠多酚化合物对质谱的正、负离子检测均有较好的信号响应。根据化合物的荷质比及相关的［6］,对图中的主要色谱峰进行了MS归属(表3)。表3 叶下珠多酚化合物的质谱数据（略）
其中各化合物的质谱中均含有相同的碎片m/z 255为鞣花酸的解离结构，说明叶下珠中主含鞣花酸型的多酚类化合物。化合物3和8均含有相同的碎片m/z593，其二级质谱图中有m/z 283,说明二化合物具有非常相似的结构，属于叶下珠素Phyllanthusiin F和E化合物。化合物3、4、5、7和8均含有碎片m/z 147，属于没食子酰基的离子峰，表明此类化合物中均含有没食子酰基。
4 讨论
4.1 药材提取方法
超声提取方法优于热循环提取，避免了加热回流导致有效成分破坏。
4.2 检测波长的确定
通过对紫外扫描图谱的分析，我们比较了220、270、340nm作为检测波长。其中270nm处出峰较多，信号较强，故以270nm为检测波长进行HPLC分离。
4.3 最佳色谱条件的筛选
实验发现等梯度洗脱时，各组分不能很好地分离，故采用梯度洗脱方法。比较不同洗脱液，结果发现甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脱能够很好的分离各组分，峰形也比较理想。80min谱图显示60min后没有酚性化合物的出现。因此确定记录时间为60min。空白实验除基线稍有漂移之外，没有杂质峰干扰。
4.4 叶下珠多酚化合物的分析
MS分析结果表明，叶下珠多酚化合物多为含没食子酰基的化合物，但游离没食子酸含量少，大部分以芸香苷、叶下珠素和鞣花酸的形式存在，因此对其质量检测时，以芦丁、叶下珠素、鞣花酸总含量为指标更具合理性。
【文献】
［1］全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编［M］,上册.北京：人民卫生出版社,1978.
［2］彭立志，贺劲松，童光东，等.叶下珠提取物抗乙肝病毒及乙肝病毒X基因的研究［J］.中西医结合肝病杂志，2006，16（6）：340?343.
［3］谢志春.叶下珠抗乙肝病毒作用的研究现状［J］.广西医学，2006，28（2）：164?166.
［4］张芝英.高效液相色谱法测定叶下珠中没食子酸的含量［J］.药业，2002，11(7)：53.
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［6］姚庆强，左春旭.叶下珠化学成分研究［J］.药学学报，1993，28（11）：829?835.
