HPLC法测定四君颗粒中的甘草酸含量
【摘要】 ［目的］用HPLC法测定四君粒颗中甘草酸的含量。［方法］HPLC用外标一点法，Kromasil ODS1 C18柱，甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸（67∶33∶1）为流动相，流速为1.0ml/min，λ=250nm；［结果］甘草酸在0.1～1?g范围内呈良好线性，回归方程为Y=444185X-9336.9 r=0.9992，平均加样回收率99.7%、RSD%为1.0%（n=6）；［结论］方法简便、准确，专属性强，测定结果重复性好，为四君子粒颗中甘草的定量分析提供了有效的方法。
【关键词】 四君子粒颗；甘草酸；HPLC
Abstract：［Objective］To establish the method for detemining the content of Glycyrrhizinatic acid in Sijunzi Keli by HPLC.［Methods］Using Kromasil ODS1 C18 Column，methyol-0.2mol/L ammonium acetate-acetic acid glacial（67∶33∶1） as the mobile phase，detection wavelength as 250nm and flow rate was 1.0ml/min.［Results］The Calibration Curve was linear at a range 0.1～1?g for the Glycyrrhizinatic acid and linear equation was Y=444185X-9336.9 r=0.9992.The average recovery was 99.7% and the related standard deviation(RSD) was 1.0%（n=6）.［Conclusion］This method was simple and accurate and proper，which could be provided for scientific quantitative analysis method of Radix et Rhizoma glycyrrhizae in Sijunzi Keli and the reduplication of the result was good.
Key words：Sijunzi Keli；Glycyrrhizinatic acid；HPLC
四君颗粒由党参、白术、茯苓和甘草四味中药组成，具有益气健脾的功能，是一古有成方，是组成各种处方的基础，没有含量测定，考虑到对照品来源的困难，甘草虽然不是君药，但在处方中起着极为重要的左使作用，加之对照品来源可靠易得，为此选择测定处方中甘草所含甘草酸的含量。
1 仪器与试药
日本岛津LC-10AT泵，SPD-10A紫外检测器；浙大N2010数据工作站。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他有关试剂均为分析纯。对照品：甘草酸铵对照品（批号为110731-200407）购自药品生物制品检定所，作含量测定用。四君子颗粒浙江得恩德制药有限司（批号为050104、050105、050106）。市售药品：天津百慕药业有限公司，批号：0410003。
2 分析方法
2.1 色谱条件
（1）色谱柱：ODS C18柱(4.6×150mm，5μm)。（2）流动相：甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸（67∶33∶1）。（3）检测波长：测定甘草酸的紫外吸收波长，证明他们在250nm有较大吸收，确定为250nm为检测波长，阴性对照无吸收峰。（4）流速：1.0ml/min；进样量：10μl。在此色谱条件下，对照品（图谱1）及经前处理后的供试品的甘草酸与其它组分基本达到分离（图谱3）。
2.2 对照品的制备
精密称取真空干燥（五氧化二磷）24h的甘草酸单铵盐对照品适量，精密称定，用流动相溶解并制成每1ml含50μg（己折合为甘草酸）的溶液，摇匀，即得(每1ml含甘草酸单铵盐对照品0.2mg折合甘草酸为0.1959mg)。
2.3 供试品溶液的制备
取本品粉末约5g，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相约45ml，超声处理（功率250W，频率20kHz）30min，取出，放冷，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 标准曲线
取“对照品的制备”项下的对照品溶液，分别进样2、5、10、15和20μl，按选定的色谱条件测定峰面积，以进样量（μl）为横坐标，峰面积为纵坐标，作图并进行线性回归，回归方程为Y=444185X-9336.9 r=0.9992结果表明甘草酸在0.1～1.0μg范围内的良好线性，见表1。表1 标准曲线（略）
2.5 检测限
精密称取甘草酸单铵盐适量，用流动相多级稀释后进样，结果在信噪比（S/N）为3时，本法的最低检测限为0.01ng/ml。结果见图1。
2.6 阴性样品的测试
做缺甘草的样品；按供试品制备法制备供试品后测定，分别测定在甘草酸相应位置无明显峰出现(图2)。
2.7 精密度试验
（1）日内精密度试验：取甘草酸铵对照品溶液，同一天不同时间进样6次，每次10μl，记录峰面积，结果RSD为0.1%，见表2。（2）日间进样精密度：取甘草酸铵对照品溶液，连续6天，每天进样1次，每次10μl，记录峰面积结果RSD为0.1%，见表2、3。表2 日内精密度试验结果（略）
以上结果表明，系统精密度良好。
2.8 样品测量的重现性试验
取批号为050104的四君子颗粒样品粉末6份，每份约5g，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相约45ml，超声处理（功率250W，频率20kHz）30min，取出，放冷，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液各10μl及对照品溶液10μl进样，计算样品中甘草酸含量，考查测定结果的一致性，测定结果RSD为0.1%见表4。结果表明，测定结果的重现性良好。表4 样品测定重现性试验结果（略）
2.9 加样回收率试验
取批号为050104的四君子颗粒样品粉末约2.5g，精密称定，共6份，分别置50ml量瓶中，加流动相约30ml，精密加入浓度为0.2mg/ml的甘草酸铵对照品溶液10ml，超声处理（功率250W，频率20kHz）30min，取出，放冷，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液各10μl及对照品溶液10μl进样，计算样品中甘草酸含量，测定结果的一致性，测定结果见表5。结果表明，本测定方法的回收率良好。表5 加样回收试验结果（略）
2.10 样品测定结果见表6。表6 样品甘草酸含量（略）
从对三批四君子颗粒中试样品的测定结果可以看出，样品中甘草酸铵的平均含量为11.8mg/袋，结合药材（炮制品）含量(1.7%)、药材的水分(10%)、提取得率、制剂得率、目前市场上已有产品的含量(6.2mg/袋)和目前中药材市场的具体情况，及本公司测定结果及大生产时实际，将成品每袋折合为甘草酸含量定为不得少于8.0mg。
3 讨论
甘草酸的含量测定方法虽然比较成熟，但在复方制剂中还是会受到其它药材成分的影响，经样品前处理后，方法在本品中还是获得比较结果。市售品含甘草酸的量各厂差异较大，我们测定多批，高的每袋达14mg，低的每袋只有4mg，认为很有必要规定甘草酸的含量，以确保药品质量。
