正交试验法优化茵栀黄颗粒提取工艺

【摘要】  优化茵栀黄颗粒的提取工艺。［方法］以干膏得率和绿原酸提取率为考核指标，采用正交设计法对茵栀黄颗粒水提取工艺进行考察。［结果］茵栀黄颗粒最佳提取工艺的方案为A2B1C2，即加水量为8倍，提取2次，每次1h。［结论］优选的提取工艺合理，适于大规模生产。
　　

【关键词】  茵栀黄颗粒 高效液相色谱法 正交试验 提取工艺

　　Abstract：［Objective］To optimize extracting procession of Yinzhihuang granules.［Methods］The extraction procession was studied by orthogonal design with dry extract yield and total flavonoids as the detective marker.［Results］ The optimum extraction condition is A2B1C2,which is added 8 fold of water,and decocted for 2 times,1 hour at every time.［Conclusion］ The optimized water?decocting condition is reasonable and scientific,and it could be used in future large?scaled preparation of Yinzhihuang granules.

　　Key words： Yinzhihuang granules;HPLC;orthogonal design;extraction technical
   
　　茵栀黄颗粒系由中药茵陈、栀子、黄芩经水提醇沉工艺而制成的颗粒剂，具有解热利尿、保肝降酶、退黄利胆的作用，用于各种黄疸性肝炎。本实验采用正交设计方法，以干膏得率和绿原酸提取率为指标，对茵栀黄颗粒水提取工艺进行优化研究。

　　1  仪器与材料
   
　　Waters 600高效液相色谱仪，Waters 600E四元泵，Waters 2996 PDA检测器，Empower工作站。
   
　　绿原酸对照品（供含量测定用）购自药品生物制品检定所，批号分别为110753?200212。药材购于义乌市医药有限公司，经鉴定符合《中国兽药典》2000版（二部）［1］规定。水为重蒸馏水，乙腈为色谱纯（上海陆都化学试剂厂），磷酸为分析纯（浙江三鹰化学试剂有限公司）。

　　2  方法与结果

　　2.1  正交试验设计  选用L9（34）正交表，以干膏得率和绿原酸提取率为考核指标，考察水提取中的加水量（A）、煎煮时间（B）和煎煮次数（C）3个因素，每个因素设3水平。其因素水平见表1。

　　表1  正交试验因素水平表（略）

　　2.2  样品提取液的制备  按处方配比称取药材适量，按正交试验表进行水提取，药液经滤纸滤过，滤液浓缩至1∶1.5（药材∶药液），备用。

　　2.3  干膏得率的测定  精密量取上述提取液20ml，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥至恒重，出干浸膏得率，结果见表2。

　　2.4  绿原酸含量的测定  （1）色谱条件  色谱柱为Symmetry?R C18柱（4.6×250nm，5mm）；流动相为乙腈?0.4%磷酸水溶液（8∶92）；流速：1mL/min；进样量：20mL；柱温：30℃；柱效：理论板数不低于4000。在此条件下，绿原酸与其他组分能达到较好分离,峰纯度达到要求，见图1。

　　图1  绿原酸对照品与样品的高效液相色谱图（略）

　　1.对照品；2.样品

　　（2）对照品溶液的制备  精密称取绿原酸度对照品4mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，即得。（3）供试品溶液的制备  精密吸取提取液1ml，置10ml量瓶中，加0.1ml冰醋酸，加水稀释至刻度，摇匀，离心，用微孔滤膜（0.45mm）滤过，取续滤液避光保存，作为供试品溶液。（4）标准曲线的制备  精密量取绿原酸对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml置10ml量瓶中，加入0.1ml冰醋酸，加水稀释至刻度，混匀，以微孔滤膜（0.45mm）滤过。各取续滤液20μl分别注入液相色谱仪,测定峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品的进样量（μg）为横坐标作图（见图2）,得到一条直，其回归方程：y=26.083x?0.0772（r=0.9999），说明绿原酸在0.1616～1.2928mg范围内，与峰面积之间呈良好的线性关系。

　　图2  绿原酸对照品的标准曲线（略）    

　　（5）精密度考察  精密吸取对照品溶液20μL，连续进样5次，在上述色谱条件下测定绿原酸对照品的峰面积，平均峰面积为1609030；RSD=0.67%。（6）稳定性试验  精密吸取供试品溶液20μl，分别于0、1、2、3、4和6h进样，测定供试品溶液中绿原酸的峰面积，RSD=1.07%，说明样品溶液在6h内稳定。（7）重现性试验  精密量取同一批提取液5份，按供试品溶液的制备项下制备试液；进样20μl，测定峰面积，RSD为1.24％，重现性良好。（8）回收率试验  精密量取已知含量的提取液6份，置10ml棕色量瓶中，分别加入绿原酸对照品，按供试品溶液的制备项下制备试液；进样20μl，依法测定绿原酸含量，回收率，结果见表3。平均回收率为99.19%，RSD=1.26%。（9）含量测定  精密量取对照品溶液4ml置10ml量瓶中，加0.1ml冰醋酸，加水至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45mm）过滤，制成每1ml含绿原酸32μg的对照品溶液。精密吸取提取液1ml，置10ml量瓶中，加0.1ml冰醋酸，加水稀释至刻度，摇匀，离心，用微孔滤膜（0.45mm）滤过，取续滤液避光保存，作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20ml；注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算，结果见表2。

　　表3  回收率试验结果（略）

　　表2  正交试验结果（略）

　　2.5  结果分析  方差分析结果见表4和表5。以干膏得率为考察指标，表2中极差R值大小显示，各因素作用主次为C>A>B；方差分析结果表明：C因素影响有显著性差异（P<0.01），A和B因素对干膏得率则无显著性影响（P>0.05），以A3B3C3组合为佳。以绿原酸提取率为考察指标，表2中极差R值大小显示，各因素作用主次为C>A>B；方差分析结果表明：A因素和B因素对绿原酸提取量无显著性影响（P>0.05），而C因素的影响有极显著性差异（P<0.05），以A2B1C2组合为佳。

　　表4  浸膏得率方差分析表（略）

　　表5  绿原酸提取率方差分析表（略）

　　2.6  验证试验  鉴于绿原酸提取量这一指标较重要，同时兼顾省时节能，故拟确定水提取工艺为A2B1C2。取同一批药材，按处方比例称取药材按A2B1C2进行验证试验，按上述方法测定干膏得率及绿原酸提取率，结果见表6。

　　表6  验证试验结果（略）

　　由表6可见，A2B1C2工艺提取的干膏得率和绿原酸提取率均与原4号样品无显著差异，故确定水提取工艺为A2B1C2，即加水量为8倍，提取2次，每次1h。

　　3  讨论
   
　　茵栀黄颗粒系复方制剂，成分复杂。根据方中各药的有效成分及其溶解性能，设计确定采用水提工艺。绿原酸系本方中主药茵陈的利胆活性成分和质量控制的指标成分［2,3］，也为本方中君药栀子中主要的有机酸类成分，具有显著的抗炎活性［4］。因此，除以干膏得率为考核指标外，同时测定绿原酸提取率，以综合评价工艺的合理性。本实验采用高效液相色谱法测定绿原酸含量，可不经分离，直接测定。方法简便、准确、灵敏，重现性及回收率均符合要求。

【】
  　　［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：化学出版社，2005.

　　［2］ 韩晋,哀海龙,张倩,等.方药配伍对茵陈蒿汤中绿原酸溶出率的影响［J］.药学杂志,2005，40（5）:399.

　　［3］ 宋小军,张永欣,张颖,等.绵茵陈药材中绿原酸定性定量方法研究［J］.中国中药杂志,2002，27（4）:347?349.