松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因表达的影响
【摘要】 ［目的］研究松花粉对衰老细胞(2BS)内细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4a及p21WAF1基因mRNA表达的影响。［方法］ 2BS细胞从28代开始培养，随机分成年轻对照组（30代）、衰老模型组（56代）、松花粉中剂量（120mg/dl）组（56代）、松花粉高剂量(240mg/dl)组（56代）。流式细胞术分析细胞周期，检测G1期比例；半定量RT?PCR法测定p16INK4a、p21WAF1mRNA的表达。［结果］衰老模型组细胞出现典型的细胞体积增大，形态不规则；松花粉处理组细胞，体积回缩，形态趋于规则。G1期细胞比例松花粉中剂量组(72.73%±1.76%)和高剂量组(64.15%±0.87%)较衰老模型组(81.33%±3.43%)显著下降(P<0.05)。细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4amRNA的表达量在松花粉中剂量组(0.3483±0.0078)和高剂量组(0.3222±0.0055)较衰老模型组(0.3974±0.0078)表达灰阶明显下调。p21WAF1mRNA的表达量在松花粉中剂量组(0.7692±0.1749)和高剂量组(0.4451±0.0363)较衰老模型组(1.1767±0.2782)。［结论］松花粉具有改善细胞衰老的作用，其分子机制可能与下调衰老细胞内细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4a及p21WAF11mRNA的表达从而改善衰老细胞G1期阻滞有关。
【关键词】 松花粉;细胞衰老;细胞周期;p16;p21
Abstract：［Objective］To observe the effects of pine pollen on the changes of p16INK4a and p21WAF1 in 2BS cells.［Method］The 2BS cells were cultured from 28 population doubling(PD) and divided equally into the young control group, old control group, middle?dose pine pollen group(120mg/dl) and high?dose pine pollen group(240mg/dl)randomly.Regulate the phases of cell cycle by flow cytometry，and then the expression of p16INK4a，p21WAF1 mRNA were determined by semi?quantitative RT?PCR.［Result］The amount of cells in G1 phase was depressed in middle?dose pine pollen group (72.73%±1.76%) and high?dose pine pollen group (64.15%±0.87%) than in old control group (81.33%±3.43%)noticeablely (P<0.05).The expression of p16INK4amRNA in middle?dose pine pollen group(0.3483±0.0078) and high?dose pine pollen group (0.3222±0.0055) was significantly decreased than in old control group(0.3974±0.0078,P<0.05)；The level of p21WAF1mRNA in middle?dose pine pollen group(0.7692±0.1749) and high?dose pine pollen group (0.4451±0.0363) was significantly lower than in old control group(1.1767±0.2782,P<0.05).［Conclusion］Pine pollen has the anti?aging effect on aging 2BS cells, this effect may be reacted via decreasing the expression of p16INK4a and p21WAF1mRNA levels in aging cells, and then down regulating the amount of cells blocking in G1 phase of cell cycle.
Key words：pine pollen；cell aging；cell cycle；P16；P21
细胞复制性衰老是目前普遍接受的细胞衰老理论，其最显著的特征即细胞出现G1期阻滞。在细胞衰老过程中细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子（CDKI）发生表达量的改变。其中p16INK4a及p21WAF1是细胞衰老诱导途径中的两个关键产物，被称为衰老相关基因［1］。其表达量与衰老的表型及衰老进程密切相关，作为检测细胞衰老的分子指标应用于衰老相关检测。松花粉是天然的营养宝库，已有的研究发现，松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞有促进增殖［2］，并提高端粒酶活性［3］的作用。本实验探讨松花粉对衰老2BS细胞中细胞周期及细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4a及p21WAF1mRNA表达量的影响。为研究松花粉抗细胞衰老的分子机制及衰老通路选择提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞培养、分组与处理 2BS细胞由北京生物制品研究所建株，28代引入。培养于15%胎牛血清的MEM培养基中，37℃,5%CO2，饱和湿度培养箱中生长。细胞寿限为60～70代。至30代时随机取8瓶作为年轻对照组，至56代时随机取24瓶分成衰老模型组、松花粉中剂量组、松花粉高剂量组3组每组8瓶，分别以单纯完全培养基、120mg/dl含花粉血清培养基、240mg/dl的含花粉血清培养基培养8天［3］，收集细胞。配制松花粉血清液，使其终浓度分别为120mg/dl与240mg/dl。
1.1.2 仪器与试剂 FACScan流式细胞仪(Beckman coulter);PCR仪（ABI9700）；凝胶成像仪（Bio?Rad）。类标准胎牛血清（FBS）购自民海生物，MEM培养基（含非必需氨基酸、谷胺酰胺）为invitrogen产品。流式细胞周期检测试剂盒（上海杰美）；cDNA试剂盒（invitrogen，superscriptIII逆转录试剂盒）。
1.2 方法
1.2.1 细胞周期测定 细胞培养至80％～90％融汇时，彻底收集细胞入15ml离心管，1500rpm,5min离心,去上清得细胞沉淀。再按细胞周期流式检测试剂盒说明进行操作。EXPO32ADC软件进行检测（美国Beckman Clouter），Multicycle for windows DNA（美国Beckman,Clouter）软件行细胞周期分析。
1.2.2 RT?PCR法检测p16INK4a及p21WAF1mRNA的表达 p16INK4a、p21WAF1特异基因及β?actin内参基因的引物均由上海生工合成。β?actin PCR引物［4］：上游5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’,下游5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3’,扩增片段为500bp；p16INK4a PCR引物［4］：上游5’ATGATGATGGGCAGCGCC3’,下游5’CGAGGTTTCTCAGAGCCT3’扩增片段为346bp;p21WAF1PCR引物［5］:上游5’CATTTGGTGGACCCAAAGAC3’,下游5’CCTCCCTTCCCCAAAGTTTA3’,扩增片段为304bp。
RNA提取与测定：采用Invitrogen公司Trizol试剂提取细胞总RNA。紫外分光光度计测定其吸光度值并RNA浓度。1%琼脂糖凝胶电泳检测其片段完整性。
逆转录反应：反应总体积为20μl，其中总RNA为5μl，随机引物(oligo(dT))1μl、M?MLV200u、RNase Inhibitor 40u、10mmol/L dNTPs 1μl、0.1mmol/L DTT 2μl、5×RT buffer 4μl。65℃变性5min后，37℃温育50min后，70℃、15min后终止反应。
PCR反应：反应体系为20μl,分别含cDNA模板2.0μl、TaqE 0.4μl、dNTP 0.25mmol/L、引物1.0μl、10×PCR Buffer 2.0μl。反应条件：94℃ 5min,94℃ 30s,56～62℃ 30s,72℃ 40s,35个循环;最后72℃延伸10min。其中β?Actin退火温度为62℃；p16INK4a退火温度为56℃；p21WAF1退火温度为56℃。
取6μl PCR扩增产物，2μl上样缓冲液在1%琼脂糖凝胶电泳上做产物检测分析,80V,30min电泳，EB染色，以GEL?DOC2000型紫外凝胶成像系统拍照，对特异基因条带进行灰度扫描，并对各特异基因/β?actin的比值进行分析。
1.3 统计处理 测定值以均数±标准差表示，采用SPSS13.0软件进行统计分析。多组间比较方差齐性时行单因素方差分析,LSD方法进行多组间两两比较；方差不齐时,采用非参数分析进行多组间比较，Dunnett’s T3方法进行多组间两两比较，以P≤0.05定为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞周期 由表1可见，56代较30代2BS细胞G0/G1期细胞比例增加(P<0.001),而120mg/dl与240mg/dl含花粉血清培养基处理组细胞均较衰老模型组G0/G1期细胞比例减少(P<0.05)。
表1 松花粉对2BS细胞细胞周期的影响（略）
与56代对照组比较，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001；△非参数方法（Kruskal?Wallis方法）
2.2 RT?PCR结果
2.2.1 总RNA完整性分析 总RNA电泳结果示，4组细胞中提取的总RNA其28S,18S条带完整，OD260/OD280比值为1.7～2.0,证明所提取的总RNA片段完整，无蛋白质污染，可用于RT?PCR反应。
图1 总RNA电泳图。（略）
1.年轻对照组；2.衰老模型组；3.120mg/dl含松花粉血清组；4.240mg/dl含花粉血清组。
2.2.2 p16INK4a及p21WAF1基因mRNA水平p16INK4a和p21WAF1基因RT?PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，进行灰度扫描分析。结果显示(图3)，120mg/dl(0.3483±0.0078）与240mg/dl（0.3222±0.0055）含花粉血清组较衰老模型组（0.3974±0.0078）中p16INK4amRNA表达量均显著下调（P<0.05）。p21WAF1mRNA表达量在120mg/dl（0.7692±0.1749）与240mg/dl（0.4451±0.0363）含花粉血清组较衰老模型组（1.1767±0.2782）也显著下调（P<0.05）。
图2 p16,p21基因PCR电泳图（略）
1.年轻对照组；2.衰老模型组；3.120mg/dl含松花粉血清组；4.240mg/dl含花粉血清组。
图3 p16,p21半定量RT?PCR表达量比较（略）
3 讨论
细胞周期是细胞生命活动中的基本过程，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。细胞周期运转是十分有序的，沿着G1期－S期－G2期－M期的顺序进行，细胞周期具有G1/S与G2/M两个调控点，其中G1/S点是启动细胞周期循环的关键。细胞衰老最显著的特征是细胞在很长一段时间内仍维持代谢活性，但因阻滞于G1期，失去了对有丝分裂原的反应和合成DNA的能力，不能进入S期。
本研究采用衰老2BS细胞模型，观察松花粉的抗衰老作用，结果显示松花粉干预能明显改善衰老细胞出现的G1期细胞阻滞，提示松花粉在体外具有一定的抗细胞复制性衰老的作用。因此本研究进一步观察了细胞周期调控蛋白p16，p21在此过程中的可能作用。
在衰老细胞中，其细胞周期蛋白（cyclin）、细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）、细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(CDKI)发生量与活性的变化。依据激活的CDKI的不同，可将衰老通路分为以下三条［6］，包括p16INK4a/RB,p19ARF/p53/p21WAF1,和PTEN/p27通路。已有大量研究表明在人胚肺成纤维细胞的衰老过程中，p16INK4a/RB和p21WAF1通路发挥着重要作用。当这些途径所涉及的关键因子发生突变，细胞将延缓衰老或绕过衰老程序继续增殖。
P16是CDK4?6/D的特异性抑制剂，通过抑制CDK4?6/D激酶的活性，使RB蛋白保持非磷酸化，减少了转录因子E2F的释放，使细胞内不能表达E2F依赖的G1晚期蛋白，使细胞DNA增殖不能通过G1/S调控点，阻滞在G1期。P16蛋白在正常生长细胞中表达水平较低［7］，但是在细胞多次复制接近衰老时其表达水平逐渐增高［8?9］，2004年Janakiraman K等学者提出P16能作为测定细胞衰老的分子标记以区别于单从时间上对衰老的界定［10］。国内Jiangming等以p16正反义载体分别转染年轻的人成纤维细胞（2BS）［11］，结果示p16INK4a的积累是衰老的诱因，而不是衰老的结果。进一步研究发现［12］，负调控机制减弱是细胞复制性衰老时p16INK4a基因高表达的重要原因。
本研究观察松花粉抗细胞衰老过程中p16表达的变化，发现在松花粉干预处理后衰老细胞的p16INK4amRNA表达量出现明显的下调。提示松花粉有可能通过抑制p16INK4a的表达，解除对Rb活性的抑制，促进E2F蛋白的释放，激活E2F依赖的G1晚期调控蛋白，促进细胞DNA增殖，改善G1期阻滞。但是松花粉对p16INK4a的抑制作用是否与激活其负调控元件有关还有待于进一步的研究。
P21WAF?1（又名p21CIP?1,p21SDI?1）则是细胞周期依赖激酶（CDK）的非特异性抑制剂。其一方面具有抑制Rb磷酸化,阻遏E2F释放,使细胞周期停留在G1/S点不能进入S期的作用；另一方面,可与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclearantigen,PCNA)结合,使依赖PCNA的DNA复制受阻,致使细胞增殖停滞在G1期［13］。在衰老细胞中，研究发现p21WAF?1的mRNA比年轻细胞增加10～20倍［14］。
本研究观察松花粉抗细胞衰老过程中p21WAF?1表达的变化情况，发现松花粉干预后衰老细胞内p21WAF?1mRNA表达量出现明显下调，提示松花粉有可能通过抑制p21WAF?1表达，促进细胞周期从G1期向S期进展，而延缓细胞的衰老。但是松花粉具体是通过p21WAF?1下游的PCNA途径、Rb途径何者起作用以及是否两条途径同时起抗衰老作用还有待进一步研究。同时松花粉通过何种机制抑制P21表达也还有待研究。以往的研究表明，p21WAF1随细胞传代表达逐渐升高，当p21WAF1升高至一定水平，p16INK4a表达开始升高，而此时p21WAF1表达水平下降，高水平的p16INK4a启动、维持并推动细胞衰老［15］。本实验中，衰老模型组、120mg/dl与240mg/dl的含花粉血清培养基处理组中，p16INK4amRNA的表达量均较p21WAF1mRNA表达量要低，可能与已知的p21WAF1先于p16INK4a表达有关。p21WAF1和p16INK4a的增加是相继的，p21WAF1表达增加出现在大多数细胞丧失增殖潜力时，而p16INK4a表达增加出现在所有细胞丧失增殖潜力时的衰老终末期。p21WAF1能在细胞复制衰老的晚期激活p16INK4a［16］。p21启动细胞衰老机制而p16INK4a维持细胞衰老的进程。
总之，本实验从细胞周期G1期阻滞角度探讨了松花粉的抗衰老作用，并进而分析了两个重要的细胞周期调控因子p16INK4a与p21WAF1 mRNA表达量的变化情况，提示松花粉可抑制p16及p21的表达，并可能通过释放其下游的Rb与PCNA蛋白，推进细胞DNA增殖进程，改善衰老细胞G1期阻滞情况，从而达到抗衰老作用。
【】
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