多孔双相钙磷陶瓷在脊柱后路融合中成骨作用和降解特性的组织学观察
作者：谢幼专，朱振安，张蒲，汤亭亭，卢建熙，戴尅戎
【摘要】 ［目的］了解多孔双相钙磷陶瓷在人体脊柱后路融合中的成骨变化及降解过程。［方法］对20例脊柱后路融合的双相钙磷陶瓷活检标本行不脱钙硬组织切片检查。观察陶瓷周围和内部的新生组织、陶瓷的形态改变、降解颗粒及伴随的细胞吞噬反应。其中14例标本行组织形态计量，根据患者的年龄、植入时间及临床结果分组比较成骨及材料降解的速度。［结果］所有的双相钙磷陶瓷标本均可见新生骨组织，与自体骨接触越多，陶瓷内的新生骨组织越多。绝大部分陶瓷内可见降解颗粒，部分颗粒位于巨噬细胞内。不同标本的新生骨和材料降解速度差异较大。陶瓷内的新生骨随植入时间的增加而增多，但随患者年龄的增大而减少。陶瓷的降解率随患者年龄的增大而减少，但不受植入时间的影响。后路融合成功组的活检标本的新生骨量高于融合失败组，但材料降解率则反之。［结论］多孔双相钙磷陶瓷是一种骨传导材料，但植入体内降解缓慢，不能被新生骨组织完全替代。植入时必须将陶瓷与自体骨充分混合以获得良好的骨长入。陶瓷产生的降解颗粒及诱发的细胞吞噬反应必须引起注意。
【关键词】 脊柱后路融合； 双相钙磷陶瓷； 骨形成； 生物降解
Abstract：［Objective］To reveal the osteogenesis, the biodegradation and tissue reactions of the porous biphasic calcium phosphate ceramic (PBC) in human spine.［Method］The histological study was carried out on 20 PBC samples retrieved from posterior spinal fusion. All the PBC samples were treated by undecalcified histological preparation. The tissue in or around the material, the change of ceramic shape,the particles and the presence of macrophages were observed. The quantitative study was performed in 14 samples with sufficient size. The residual material and the newly formed bone were analyzed according to the patient age，the duration in vivo and clinical results.［Result］Newly formed bone was found in all the samples. More new bone was formed in those samples closely in contact with autogenous bone. The PBC degradation particles were present both in the macrophages and around the tissue. But those phenomena were highly variant among the samples. New bone formation increased with time and decreased with the age. The material degradation decreased with the age, but it did not differ greatly with time. New bone formation was higher and the residual material was lower in the fusion group than in the non?fusion group.［Conclusion］The PBC is a kind of osteoconductive material and does not transform into new bone after a relatively long time. The PBC should be well mixed with the autogenous bone in order to achieve high new bone colonization. The PBC degradation particles and related active phagocytotic activity have been noted.
Key words：posterial spinal fusion; calcium phosphate ceramic; osteogenesis; biodegradation
退行性椎间盘病变、脊柱不稳和脊柱侧弯等疾病的手术常需进行脊柱后路融合。自体骨移植是促进融合的金标准方法，但自体骨供区并发症的发生率可高达24%。此外，自体骨的取骨量有限，不能满足日益增加的翻修手术需求。尽管融合时也可采用同种异体骨，但免疫排斥反应及潜在传播传染性疾病的可能又使其应用受到一定的限制。近年来，人工合成的多孔双相钙磷陶瓷日益受到重视并应用于临床,且在动物［1］和人体［2］的脊柱后路融合中取得了良好的效果。然而，大多数临床研究主要以影像学改变和临床症状、体征的改善为评判标准，组织学活检观察甚少。大多数组织学观察来源于动物实验研究，但由于物种的差异，低等脊椎动物的实验结果不能完全代表人体的生物学改变。由于组织学观察能最直观地了解这些材料在人体内的生物学变化，因此，本研究对20例脊柱后路融合手术的多孔双相钙磷陶瓷活检标本进行组织学观察，以较真实地了解其在人体的生物学改变。
1 材料与方法
1.1 病例资料
1993～2002年法国Calot共收集20例多孔双相钙磷陶瓷活检标本，均取自脊柱后路融合的患者。其中男2例，女18例；年龄11～70岁（平均45.2岁）。原发性诊断包括先天性脊柱侧凸畸形（1例），特发性脊柱侧凸畸形（11例），退变性脊柱侧凸畸形（7例），腰椎不稳（1例）。最大融合范围从T1至骶骨。每例融合手术均使用内固定器械固定，双相钙磷陶瓷和自体骨混合植骨。活检时间为术后2～56个月（平均24个月）。所有活检均在患者行第２次脊柱后路手术时进行。患者接受２次手术的原因包括内固定器械拆除（6例）、融合失败（8例）、融合区临近节段椎间盘突出（3例）、腰椎不稳（2例）、重置内固定（1例）。活检标本来源于腰段（15例）、胸腰段（1例）、胸段（1例），有3例标本取自的节段未详细记载。
1.2 植入材料
本组患者中，17例应用条状双相钙磷陶瓷（5 mm×5 mm×20 mm），3例应用颗粒状陶瓷（直径1～3 mm）。该陶瓷由磷酸三钙（40%）和羟基磷灰石（60%）组成，孔径为300～600 μm，孔隙率约为50%±10%。脊柱后路融合采用混合植骨，即双相钙磷陶瓷与局部去皮质骨粒（16例）或自体髂骨（2例）混合移植。2例自体骨来源记载不明。
1.3 组织形态学观察及计量
所有标本在取材后立即用10%中性福尔马林浓液固定，14 d后用梯度乙醇浓液脱水，甲苯透明后用甲基丙烯酸甲酯包埋。应用Leica锯式切片机切片，切片初始厚度约为200 μm，研磨至约50 μm厚，抛光后用苦味酸-品红溶液染色。
每个标本观察2张连续切片。观察指标有：双相钙磷陶瓷周围和内部的新生组织；陶瓷形态的改变；颗粒及伴随的细胞反应。本组标本中，6例因体积过小，无法进行定量研究，仅进行形态学观察；其余14例标本较大，且均为条状陶瓷，进行组织形态计量学测量。测量的指标主要有：
(1)新骨形成率（VPB）=陶瓷内部形成的新骨面积/陶瓷孔的总面积；
(2)材料残余率（VRM）=残存的陶瓷面积/植入陶瓷的总面积；
(3)新骨占孔率（NbB）=形成新骨的孔数/总的孔数；
(4)材料周边的骨接触率（PIB）=与骨接触的材料周长/材料的总周长。
1.4 统计学处理
所有结果用均数表示。植入时间与新骨形成率（VPB）、新骨占孔率（NbB）之间的关系采用Spearman秩相关分析，同法分析材料周边的骨接触率（PIB）和新骨形成率（VPB）、新骨占孔率（NbB）之间的关系。
2 结 果
所有的双相陶瓷标本均可见新骨形成，但不同病例的新骨形成率差异较大。11例陶瓷标本内可见大量的新骨形成(图1a)，9例标本仅在陶瓷周围的孔内形成新骨(图1b)。与自体骨紧密接触的陶瓷中形成的新骨较多。仅形成少量或未形成新骨的陶瓷孔内可见纤维组织形成。从整体上看，双相钙磷陶瓷的骨架结构变化不大，孔连接径大小很不均一。陶瓷周围和内部可见降解颗粒，其中19例标本观察到数量不等的材料降解颗粒，颗粒周围可伴随活跃的多核巨细胞，细胞内可见吞噬的降解颗粒(图2a，2b)。一些降解颗粒和吞噬细胞位于材料的表面，但在形成新骨的陶瓷表面，未见降解颗粒。
14个标本行组织形态学计量测量，植入时间为2～43个月，新生骨组织为33%（VPB）或38%（NbB）。陶瓷周边的骨接触率为19%。材料残余率为52%，与植入前变化不大。
根据患者年龄将14例陶瓷标本分为3组：少年组（<20岁）3例；青中年组（20～50岁）6例；老年组（>50岁）5例。结果表明材料的残余率随年龄增大而增多，新生骨随年龄组增大而减少。新骨形成率最大的病例出现在少年组内，达81.8%(图3)；新骨形成率最小的病例出现在青中年组内，仅0.6%。
根据陶瓷植入体内的时间分3组：1年内3例，1～2年5例，2年以上6例。结果发现材料内新生的骨组织随植入时间的延长而增多，材料残余率随植入时间变化不大。
根据最终是否融合成功分为2组：融合成功组9例，融合失败组5例。结果显示融合成功组新骨形成率（VPM，37%；NbM, 41%）明显大于融合失败组（VPM，24%；NbM, 33%）。材料的残余率则融合成功组（51%）低于融合失败组（53%），即融合成功组的材料降解较快。
相关分析研究发现植入时间与新骨形成率VPB（r=0.05, P=0.86）、新骨占孔率NbB(r=0.14, P=0.62)无显著相关，但材料周边的骨接触率PIB与新骨形成率VPB（r=0.84, P<0.01）、新骨占孔率NbB(r=0.81, P<0.01)呈显著相关。
3 讨 论
应用多孔双相钙磷陶瓷促进脊柱后路融合已取得较好的临床效果。双相钙磷陶瓷由磷酸三钙和羟基磷灰石组成，具有与骨基质相同的化学成份，多孔结构有助于骨髓基质干细胞移行、贴附、增殖和分化为成骨细胞，可作为骨传导性支架促进骨长入，因此本研究中的所有陶瓷均形成不同数量的新骨。但不同病例的新生骨量的差异较大，这是由于脊柱的融合过程还受到如患者年龄、植入材料、植入部位的机械环境及植骨床的准备情况等因素的影响。
图1a 双相陶瓷的周围孔及中心孔均可见新骨形成，陶瓷周围与自体骨(星号)紧密接触。（苦味酸－品红染色，×3.125） 图1b 双相陶瓷的周围孔形成少量类骨质（箭头）和矿化骨（星号），中心孔见纤维组织形成，无新骨。注意陶瓷周围无自体骨。（苦味酸－品红染色，×3.125） 图2a 双相陶瓷的孔内可见新骨形成，周围有大量的降解颗粒。（苦味酸－品红染色，×50） 图2b 高倍视野下可见陶瓷降解颗粒位于多核巨细胞内或细胞外。（苦味酸－品红染色，×100） 图3 来源于19岁患者的双相钙磷陶瓷标本，可见大量新骨（类骨质：黄绿色；矿化骨：红色）形成，陶瓷表面覆盖新生骨，未见降解颗粒。（苦味酸－品红染色,×25）
从材料结构上分析，双相钙磷陶瓷的孔与孔连接的不均一可引起本研究中不同病例间新生骨量的差异。研究表明孔径为300 ～600 μm的陶瓷适于骨组织长入［3］，孔连接径为30 μm的陶瓷比60 μm的陶瓷形成的纤维组织多，孔连接径大于50 μm能确保矿化骨的形成［3］。本组材料具有良好的孔径（300～600 μm），但孔连接径大小很不不均一，而导致新生骨量的差异。此外，羟基磷灰石在体内难以降解，而磷酸三钙植入体内４周后就开始降解，因此，当双相钙磷陶瓷的磷酸三钙成分开始降解后，羟基磷灰石仍未降解，材料的大体骨架仍然存在，材料的孔与孔连接也不会发生显著改变。本组钙磷陶瓷植入后残余材料的孔隙率与植入前变化不大，表明材料本身的结构未发生明显的改变或材料未降解。有些陶瓷植入体内长达4年余，但仍未能降解消失或转化成骨组织，因此，双相钙磷陶瓷仅是一种骨传导性支架，而非骨替代物，双相钙磷陶瓷不会被新骨完全替代［4］。近年研究表明引入干细胞或诱导因子能促进其成骨［5］。
本研究发现陶瓷内新生骨量随年龄增加而减少，随植入时间的延长而增加；一少年患者植入双相钙磷陶瓷38个月后，陶瓷活检标本显示其新生骨量最大，达81.8%。这一结果表明双相陶瓷的成骨量受患者的年龄和植入时间的影响：青少年的成骨活动较活跃，新生骨量也较大。此外，陶瓷内成骨量还与融合技术有关。近年研究表明双相陶瓷必须与自体骨（如局部去皮质骨粒）混合植入，与自体骨紧密接触的陶瓷的新生骨明显增多［1］。本研究发现未接触自体骨的双相钙磷陶瓷成骨量较低(0.6%～22%)，相关分析表明植入钙磷陶瓷与自体骨接触越紧密、越多，陶瓷内部形成的新骨越多，与报道一致，这是因为植骨床、植骨块或去皮质骨粒在新骨长入的过程中起重要的作用。去皮质良好的植骨床及局部骨片能提供含骨髓干细胞的骨髓，而良好的接触能确保来自于植骨床或自体骨块的骨髓基质干细胞抵达陶瓷，从而促进陶瓷内部和周围形成新骨，因此，行脊柱后路融合时必须将植骨床充分去皮质化，并使植骨块或去皮质骨粒与钙磷陶瓷充分混合，使其相互接触，才能确保较多地骨长入。双相钙磷陶瓷的生物降解过程较复杂，机械磨擦、化学溶解、细胞吞噬及细胞活动产生的酸性环境都能使其降解［6］。此外，陶瓷的烧结工艺对陶瓷的降解有重要的影响。为了保证双相钙磷陶瓷中的有效成份，烧结温度往往较低，使磷酸三钙颗粒、羟基磷灰石晶体间的连接较弱，植入体内后易形成降解颗粒，诱发细胞吞噬反应［6, 7］。由于羟基磷灰石颗粒较难溶解，细胞吞噬后会引起细胞损伤，从而影响骨形成和脊柱融合［7］。由于本研究中最早的病例和最迟的病例相差达8年之多，使用的双相陶瓷可来自不同的批号，这些因素都可影响本研究中各标本的成骨和降解。
本研究所有病例在植骨融合的同时都进行了内固定术，因此所有植入的双相陶瓷具有稳定的生物力学环境，但从严格意义上说，脊柱后侧和后外侧融合的生物力学环境不尽相同，动物实验表明横突间融合术陶瓷的新骨形成率明显低于椎板间融合术。本研究部份病例的融合部位在腰段，标本的取材部位可为椎板、关节突或横突间。由于具体活检部位的记载不够详尽，因此不能进一步分析这些差异，今后根据不同植入部位进一步研究有助于阐明这些差异。
4 致 谢
感谢法国Calot骨科Chopin医师和Morin医师热情地提供临床标本，感谢法国Littoral大学生物材料和生物技术研究所Hardouin教授对研究所作的悉心指导。
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