芪仙安肠方对大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用及机制
作者：田军彪 单兆伟 刘建平 赵红伟 康薇
【摘要】 目的 探讨芪仙安肠方对三硝基苯磺酸（TNBS）诱导溃疡性结肠炎模型大鼠的疗效及作用机制。方法 采用TNBS诱导制备溃疡性结肠炎大鼠模型40只,随机分为模型组、阳性对照组及芪仙安肠方低、中、高剂量组，各8只,并选未造模大鼠8只作为正常对照组。各组均灌胃给药,模型组和正常对照组予0.9%氯化钠注射液，阳性对照组予柳氮磺吡啶（SASP）0.50 g/kg，芪仙安肠方低、中、高剂量组分别给予相应剂量(5.0、10.0、20.0 g/kg) 的芪仙安肠方原液，均每日1次。给药时间从造模后第3日开始,连续14日。造模后第18日观察各组大鼠结肠黏膜损伤指数(CMDI)及黏膜病理组织学情况,并检测免疫球蛋白（Ig）A、IgG、补体3（C3）、补体4（C4）、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)及白细胞介素-4(IL-4)含量变化。结果 芪仙安肠方低、中、高剂量组结肠黏膜病理损伤明显改善，CMDI均降低,C3、C4及IL-4含量明显提高，IgA、IgG、TNF-α、IL-2含量降低，与模型组比较差异均有统计学意义（P<0.01）；芪仙安肠方中、高剂量组后CMDI、C3、C4、IL-2、IL-4、TNF-α含量与正常对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）,与阳性对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论 芪仙安肠方对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎疗效确切，中、高剂量尤其显著,其作用机制可能与免疫调节和减轻细胞因子损伤有关。
【关键词】 结肠炎 溃疡性 中药疗法 免疫球蛋白A 免疫球蛋白G 补体3 补体4 肿瘤坏死因子α 动物实验
A study on the therapeutic effect and mechanism of Qixiananchang decoction on ulcerative colitis of rats
【Abstract】 Objective To observe the therapeutic effect and mechanism of Qixiananchang decoction on ulcerative colitis of rats induced by trinitrobenzene sulphoacid (TNBS). Methods 40 SD rats were induced by TNBS and modeled and divided into 5 groups: model group, positive control group, high-dose, mid-dose, low-dose Qixiananchang decoction groups, with 8 rats in each group. There were also 8 non-modeled SD rats in normal control group. All groups were clystered: positive control group was treated by Salazosulfapyridine (SASP) 0.5 g/kg, high-dose, mid-dose and low dose groups were given Qixiananchang decoction respectively (5.0 g/kg,10.0 g/kg, 20.0 g/kg) from the 3rd day after modeling for 14 days and recorded the changes of the following values: CMDI, mucous membrane histopathology, IgA,IgG,C3,C4,-α(TNF-α),IL-2,IL-4 after 18 days. Results The therapeutic effects in all Qixiananchang decoction groups were superior to those in model control group (P<0.01). There was no significant differences between mid/high dose groups and normal control group (P>0.01),and there was a significant difference between mid/high dose groups and positive control group (P<0.01). Conclusion Qixiananchang decoction is effective in treatment on ulcerative colitis of rats induced by trinitrobenzene sulphoacid, especially in mid-dose and high-dose groups. Its mechanism may have a close connection with immunoregulation and alleviation of cytokine damages.
【Key words】 Qixiananchang decoction; Ulcerative colitis; TNBS; Immunoglobulin; Complement; Cytokine
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种临床常见的反复发作性、难治性消化系统疾病。芪仙安肠方具有健脾益气、清热燥湿、化瘀解毒的功效。现以三硝基苯磺酸（TNBS）为半抗原诱导建立大鼠UC模型,观察芪仙安肠方对其治疗作用并探讨相关机制。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 芪仙安肠方（药物组成：黄芪12 g，炒白术10 g，仙鹤草15 g，败酱草12 g，黄连3 g，白及12 g，炒白芍药15 g，煨木香6 g，血竭2 g）原液(由河北省中制剂室提供,每mL含生药2.0 g)，芪仙安肠方低、中、高剂量(5.0、10.0、20.0 g/kg)分别相当于临床成人日用量的3.5、7、14倍。柳氮磺吡啶(SASP)（上海三维制药有限公司,批号: 200609C15）；三硝基苯磺酸（TNBS）（日本TCI公司，批号：P1315）;ELISA试剂盒为RD公司产品；免疫球蛋白试剂盒由四川迈克科技有限责任公司提供。
1.2 实验动物 SD大鼠48只，雄性，体质量180～200 g,由河北医科大学实验动物中心提供。动物等级: 清洁级。合格证号:612168。
1.3 仪器 日本奥林帕斯显微镜（型号BX51T-PHD-J11）；莱卡RM 2135切片机（德国LEICA） ；LG15-W高速微量离心机（北京医用离心机厂）；BM-Ⅱ型病理组织包埋机（安徽研究所）；Biocell 2010酶标检测仪（奥地利Anthos Labtec Instruments公司）。
1.4 造模方法 实验前禁食24 h，自由饮水，在乙醚麻醉下,用直径2 mm的硅胶软管经肛门轻插至结肠8 cm处,推入含TNBS 20 mg的30%乙醇溶液0.5 mL，捏紧肛门平放10 min即可。3日后即为造模成功［1，2］。
1.5 动物分组及给药方法 将造模大鼠随机分为5组，各8只。各组均于造模后第3日灌胃给药，模型组予0.9%氯化钠注射液;芪仙安肠方低、中、高剂量组分别予相应剂量(5.0、10.0、20.0 g/kg)；阳性药对照组予SASP 0.50 g/kg。另取8只未造模大鼠作为正常对照组,予0.9%氯化钠注射液。均每日1次,共14日。
1.6 观察指标及检测方法 造模后第18日,各组大鼠均予2%戊巴比妥麻醉, 腹主动脉取血做生化检查。用免疫比浊法检测血清免疫球蛋白（Ig）A、IgG、补体3（C3）、补体4（C4）。ELISA法检测血清瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)的变化。取出全结肠,纵向剪开,冲洗掉污物,测量结肠长度及最大宽度,肉眼观察结肠的损伤情况。黏膜损伤指数（CMDI）评分标准［3］:粘连，0分:无;1分:轻度(结肠与其它组织剥离较易);2分:重度。溃疡形成及炎症，0分:无; 1分:局部充血,无溃疡; 2分: 1处溃疡不伴充血或肠壁增厚;3分:1处溃疡伴炎症;4分:≥2处溃疡伴炎症;5分:≥2处溃疡和(或)炎症>1 cm; 6～8分:溃疡和(或)炎症＞2 cm,病变范围每增加1 cm,计分加1分。在病变最严重处剪取一块结肠,甲醛固定,石蜡包埋,HE染色,光镜下观察病理组织学变化。其余结肠称其质量,与剪取的结肠之和为结肠质量。
1.7 统计学处理方法 各组检测结果用均数±标准差（x±s）表示,组间比较采用t检验。用SPSS 11.5软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 对大鼠一般状态的影响 正常组大鼠反应灵活，毛色光润，喜活动，主动觅食，大便呈小球状。其余5组大鼠造模后第2日开始精神萎靡，懒于活动，被毛松散无泽，拱背，食量下降，拉稀便或黏液血便，形态消瘦，体质量下降，粪隐血试验呈强阳性。芪仙安肠方低、中、高剂量组及阳性对照组治疗5～7日后,稀便基本消失,状态恢复接近正常,但体质量仍明显减轻；粪隐血试验虽呈阳性,但程度明显减轻;腹泻、黏液便等症状也有所改善，渐为软便；食量渐增，活动明显增多，精神状态好转。其中芪仙安肠方高、中剂量组疗效最佳。
2.2 对大鼠组织病理形态学的影响
2.2.1 肉眼观察 正常对照组大鼠结肠黏膜光滑,纹理清晰,未见充血、水肿。模型组肠管变狭小，肠壁增厚，黏膜可见多个溃疡，溃疡旁黏膜充血、水肿明显。芪仙安肠方低、中、高剂量组及阳性对照组损伤明显减轻，尤以芪仙安肠方高、中剂量组明显，高剂量组结肠溃疡面积显著缩小,水肿消失,肠腔未见粘连。
2.2.2 各组CMDI积分比较 见表1。
表1 各组CMDI的积分（略）
与正常对照组比较，△P<0.01; 与模型组比较，*P<0.01；与阳性对照组比较，＃P<0.01
由表1可见，芪仙安肠方高、中、低剂量组CMDI积分明显下降，与模型组比较差异均有统计学意义（P<0.01）；芪仙安肠方高、中剂量组CMDI积分与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），与阳性对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。
2.2.3 光镜观察 模型组镜下可见中性粒细胞明显浸润,杯状细胞轻度减少,黏膜组织可见肉芽肿,未见纤维化, 偶见隐窝脓肿。芪仙安肠方低、中、高剂量组及阳性对照组均表现出明显的作用，芪仙安肠方高剂量组镜下溃疡面积较模型组显著缩小,炎性细胞浸润减少,炎症多局限于黏膜层,未见肉芽组织。正常对照组黏膜上皮细胞完整，腺体排列整齐，结构清晰。
2.3 各组IgG、IgA及C3、C4含量比较 见表2。
表2 各组IgG、IgA及C3、C4含量比较（略）
与模型组比较，*P<0.05；与阳性对照组比较，＃P<0.05;与正常对照组比较，△P<0.05
由表2可见，芪仙安肠方低、中、高剂量组IgG、IgA含量均明显降低,C3、C4水平升高，与模型组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组、芪仙安肠方低剂量组和阳性对照组与正常对照组比较均有统计学意义(P＜0.05)；芪仙安肠方高、中剂量组IgG、IgA及C3、C4含量与正常对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）,与阳性对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4 各组血清IL-2、IL-4及TNF-α含量比较 见表3。
表3 各组血清IL - 2、IL -4及TNF-α含量比较（略）
与正常对照组比较，*P<0.01;与模型组比较，＃P<0.05；与阳性对照组比较，△P<0.05
由表3可见，芪仙安肠方低、中、高剂量组血清IL-4含量升高,IL-2、TNF-α含量降低，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）;芪仙安肠方高、中剂量组治疗后血清IL-2、IL-4及TNF-α含量与正常组比较差异均无统计学意义（P>0.05），与阳性对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）；模型组、阳性对照组与正常对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。
3 讨论
UC是一种以黏膜和黏膜下层炎性浸润为主,特发于结肠的非特异性炎症性肠病。近年发病有增加的趋势，目前尚缺乏有效的治疗方法，临床常予抗感染剂、皮质类固醇类、免疫抑制剂等对症治疗，长期疗效不佳,副作用明显。UC属中医学泄泻、久痢、肠癖等范畴,为本虚标实之证。治以益气健脾、清热利湿、化瘀解毒之法,屡获良效。本实验采用TNBS+乙醇灌肠造成大鼠UC模型,在组织学变化上与人类UC有一定的相似［4］。本研究结果显示，芪仙安肠方对TNBS诱导UC模型大鼠有较好的治疗作用,主要表现为明显减轻结肠溃疡,镜下溃疡面积缩小,炎性细胞浸润显著减少,病变深度明显减轻。
一般认为UC是在遗传物质基础上,由于抗原刺激和体内免疫系统的激活,各种环境因素相互作用而引起的一种以肠道炎症为主要表现的慢性疾病［5］。UC结肠黏膜浆细胞合成抗体异常,其固有膜中IgG、IgM浆细胞异常增多,病损区可见免疫复合物或颗粒状沉积，从UC患者的肠黏膜中纯化出一种特定的IgG抗体,为UC的自身免疫发病机制进一步提供了依据。本研究发现TNBS造模的大鼠，血清IgG、IgA含量异常增高，补体C3、C4含量降低，经过芪仙安肠方治疗,大鼠血清IgG、IgA含量明显降低,补体C3、C4含量升高，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05),提示抑制IgG、IgA合成，提高补体水平,可能是芪仙安肠方免疫调节作用的一个方面。
TNF-α是一种促炎症性蛋白,能诱导多种细胞增生、凋亡,激活血管内皮细胞,继而表达多种细胞因子和黏附因子引发一系列的炎性细胞浸润和炎症反应。IL-2是一种强而有力的中性粒细胞趋化因子和活化因子，主要生物学作用是趋化并激活中性粒细胞，促进中性粒细胞的溶酶体酶活性和吞噬作用，对嗜碱性粒细胞和T淋巴细胞也有一定的趋化作用。这些生物学活性与炎症反应密切相关，故IL-2及相关的趋化因子在炎症反应中起更直接的介导作用［6］。IL-4主要由CD4阳性T淋巴细胞Th2亚群分泌的，对Th2的分化最为关键，属炎性抑制因子与上述TNF-α、IL-2等致炎因子相抗衡。肠道炎症的启动及其慢性化在很大程度上可能与炎性因子与抑炎性因子的失衡有关［7～9］。我们观察到，UC大鼠表现为细胞因子TNF-α、IL-2含量增高，IL-4含量降低。芪仙安肠方各组可明显升高IL-4 含量,降低IL-2、TNF-α含量（P<0.05），高、中剂量组优于阳性对照组（P<0.05），可以看出细胞因子变化与UC治疗效果密切相关。
本研究结果显示，芪仙安肠方对大鼠UC模型有明显的治疗作用，结合研究可以推测，免疫调节作用和消除细胞因子对结肠黏膜的损伤作用是其主要机制之一。
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