复方木鸡冲剂抑制HepG2细胞增殖及诱导分化的作用
【摘要】 目的：探究复方木鸡冲剂在体外对人肝癌细胞株HepG2的抗增殖作用及其机制。方法：光镜观察细胞形态的变化。MTT法检测木鸡冲剂对肿瘤细胞增殖的抑制作用。流式细胞仪分析细胞凋亡的情况。全自动生化分析仪检测培养上清液中GGT、ALP浓度的变化；免疫细胞化学法检测细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子P21WAF1的表达。结果：复方木鸡冲剂对HepG2有明显的抑制生长作用，细胞凋亡率明显增高，培养上清中ALP浓度升高，AFP浓度降低，P21WAF1表达呈强阳性，而GGT没有明显变化。结论：复方木鸡冲剂明显抑制HepG2细胞的生长，其抗肿瘤的机制与诱导肿瘤细胞凋亡和促分化有关。
【关键词】 复方木鸡冲剂 肝细胞癌 凋亡 分化
Study on inhibition proliferation and differentiation
【Abstract】 Object To study the inhibition effect and mechanism of Muji Chongji on hepatocarcinoma cell line HepG2. Methods MTT assay was adopted to describe the proliferation of carcinoma cells. Apoptosis induced by Muji Chongji was investigated by applying light microscopy and flow cytometry (FCM), The contents of γ-glutamyl transpeptidase (γ-GT) and alkaline phosphatase (ALP) in the supernatant were determined by biochemistry techniques, α-fetoprotein (AFP) was detected by radioimmunoassay. Immunohistochemical staining was performed to determine the protein of p21WAF1. Results：Our results showed Muji Chongji reduced HepG2 cell viability obviously(p<0.01); changes of apoptosis in morphology of HepG2 treated with Muji Chongji was appeared and apoptotic cells rate increased (p<0.05); significantly decreased AFP value of HepG2 secretion and increased ALP value. Our study also showed that Muji Chongji induced up-regulation of p21WAF1 protein. Conclusion Fufang muji Chongji can inhibit the proliferation of HepG2 cells and induce apoptosis in HepG2 cells.The mechanism of anti-tumor activities of Fufang muji Chongji is that induce differentiation in HepG2 cells and there is significant correlation with cell cycle inhibitor p21WAF1.
【Key words】Muji Chongji; HepG2 cell line; apoptosis; differentiation
原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤，死亡率很高。在家发病率占全球肝癌病例80%以上而我国发生的肝癌占全世界发病率的42.5%[1]。目前肝癌的药物中是以化学药品为主，但化学药品的开发费用昂贵，毒副作用大，多有不同程度的致突变毒性。因此，人们把目光转向中药，试图从天然成分中寻找毒副作用小。作用独特的抗肿瘤药物。复方木鸡冲剂[2-3]是我国传统的珍贵药材，具有抑制甲胎蛋白升高和调节免疫功能的作用，已用于临床治疗肝硬化、肝炎等肝脏疾病，但对该药抗肿瘤作用机制的研究很少，本实验通过复方木鸡冲剂对人肝癌细胞系HepG2作用的系列分析及与细胞凋亡和分化的关系。探讨该药的抗肿瘤效应，为中药在肿瘤治疗中的应用提供。
1 材料
1.1 细胞株 人肝母细胞瘤HepG2细胞由大连医科大学病理生理教研室冻存保种。细胞接种于含10％FBS的DMEM全培养基中, 在37℃，5％CO2饱和湿度孵箱中孵育, 2～3天传代一次，待细胞铺满瓶底的80％～90％时进行传代。传代时用胰蛋白酶进行消化，使细胞与瓶壁脱离，加全培基终止消化，制成单个细胞悬液，取对数生长期细胞用于实验。
1.2 主要试剂和仪器 L-DMEM(GIBCOU公司），胎牛血清（FBS, ISRAEL公司），Caspase3、Bcl-2、P21WAF1单抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，复方木鸡冲剂（丹东药业有限公司，批号31203），β-榄香烯（大连金港制药厂），MTT（华美生物工程公司），Annexin V/PI（南京凯基生物科技发展有限公司），流式细胞仪 (FACS Calibur, BD公司)，全自动酶标仪（Multiskan Ascent V1.24 Clin-Bio 120C）。
2 方法
2.1 MTT法检测HepG2细胞增殖活性 取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，离心1000rpm，5min，弃上清，加入含10%FBS的DMEM培养液制备成浓度为1×105/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 ul。实验设空白对照组，阳性药物对照组（β-榄香烯）及木鸡冲剂组，每组设4个平行孔,于37℃，5%CO2条件下分别培养24h、48h、72h后，每孔加15 ulMTT液，避光继续培养4h后离心，弃上清，加DMSO 150ul/孔，在自动酶标仪上以570nm波长测定各孔OD值，药物对肿瘤细胞的生长抑制率:抑制率=(1-实验组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100%
2.2 细胞形态学观察 取复方木鸡冲剂作用24h、48h和72h后的HepG2细胞涂片，凉干，瑞氏-姬姆萨染色，显微镜下观察细胞的形态，常规培养细胞作空白对照。
2.3 流式细胞仪 (Annexin V/PI双染法) 检测 收集经复方木鸡冲剂处理24h和72h的HepG2细胞（1～5×106），预冷PBS液洗两遍，吸取250ul的1×Binding Buffer和250ul灭菌去离子水,混匀,用上述500ul的1×Binding Buffer悬浮细胞,加入1ul Annexin V-EGFP,混匀后加入5ulPI，混匀，室温下避光反应15min后上机检测凋亡发生情况。
2.4 全自动生化分析仪检测GGT、ALP 收集药物作用48h的HepG2细胞，经全自动生化分析仪检测GGT、ALP含量，与常规培养细胞的上清液比较，实验重复三次，计算平均值。
2.5 HepG2细胞AFP分泌量的测定 收集药物作用48h后的HepG2细胞，用放射免疫测定法检测AFP的含量，常规培养HepG2细胞上清液的AFP含量为对照，实验重复三次，计算平均值。
2.6 免疫细胞化学方法检测细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子P21WAF1的表达 对数生长期的HepG2细胞经5%的复方木鸡冲剂作用24h、48h和96h后，收集细胞，pH7.4 PBS洗涤3次，将细胞悬液均匀涂抹于防脱片剂处理的载玻片上，干燥后冷丙酮4℃固定10min，3%过氧化氢室温作用10min，非免疫兔血清封闭20 min，按试剂盒要求加入P21WAF1单抗，4℃孵育过夜，pH7.4PBS洗涤3次，然后与生物素标记的抗羊IgG，室温孵育15min，pH7.4 PBS漂洗后，加链酶亲和素-碱性磷酸酶溶液（SABC-AP），室温下反应20min，pH7.4PBS洗涤3次，加入新鲜配制的DAB显色10min，苏木素复染，梯度酒精脱水后，中性树胶封片，以pH7.4 PBS代替一抗为空白对照。显微镜下观察药物作用后P21WAF1蛋白的表达情况。
3 结果
3.1 复方木鸡冲剂对HepG2细胞生长的影响 经复方木鸡冲剂处理后HepG2细胞的生长明显低于空白对照组（p＜0.01），见表1。24h的抑制率达63.0%,这种生长抑制作用不随时间的延长而增加（48h、72h的抑制率为 49.6%和46.6%）。 表1 复方木鸡冲剂对HepG2细胞的生长抑制情况
3.2 复方木鸡冲剂处理后细胞形态的变化 HepG2细胞为贴壁生长的细胞，经复方木鸡冲剂处理后细胞的密度与空白组比减少，细胞之间的连接疏松，培养液中细胞悬浮的增加，贴壁细胞明显减少。瑞氏-姬姆萨染色可见，经复方木鸡冲剂处理48h后的HepG2细胞形态由多角形转变为长梭形或树枝状，有突起伸出。细胞体积明显缩小，细胞核变小，固缩而深染，染色质凝集，核仁数目变少，肾形核多见，核浆比例降低，细胞分裂相减少。
3.3 复方木鸡冲剂对HepG2细胞诱导凋亡的作用 HepG2细胞经复方木鸡冲剂作用后发生了凋亡的现象（表2，显示与空白对照组比p<0.05），在处理24h和72h后，凋亡率明显增加，分别为47.07%和48.47%。处理24h后早期凋亡率和晚期凋亡率差别不大，继续作用至72h后以晚期凋亡细胞为主。 表2 复方木鸡冲剂作用HepG2细胞后的凋亡率变化 注：木鸡冲剂VS对照组（P＜0.01），△木鸡冲剂VS榄香稀（P＜0.01）。
3.4 细胞培养上清中GGT、ALP和AFP浓度的变化 经复方木鸡冲剂处理48h后，HepG2细胞培养上清液中GGT的浓度有所下降，但与处理前比无统计学差异(表3，p﹥0.05)；ALP的浓度在药物处理48h后，明显升高(表3，p﹤0.05)。经复方木鸡冲剂处理后HepG2细胞AFP分泌量明显降低(与处理前比p<0.05，表3)。表3 培养上清中GGT、ALP含量的变化注：△木鸡冲剂组VS空白对照组，P＜0.05。
3.5 复方木鸡冲剂对HepG2细胞p21 WAFI蛋白表达的影响 免疫细胞化学检测可见常规培养的HepG2细胞内p21WAFI蛋白表达较弱，呈弱阳性显色反应，浅黄色反应产物主要分布于细胞质中，核内仅有微量分布。经复方木鸡冲剂处理的HepG2细胞p21 WAFI蛋白表达明显增强，为强阳性反应，反应产物为深棕黄色，细胞质内p21 WAFI蛋白表达产物明显增加，主要分布于核周边细胞质区域，细胞核内的蛋白分布也明显增多，结果见图1。
4 讨论
恶性肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病之一，据WHO统计，每年约有200万人患癌，约80万人接受化学，寻找有效的抗癌药物和方法，是世界医学面临的重要课题。医学界在寻求和使用抗癌药物的同时发现，许多化学抗癌药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞，且临床上用于治疗肿瘤的化学药物大多数品种都有不同程度的致突变遗传毒性，因此治疗肿瘤的同时增加了病人患第二种肿瘤的可能性，而植物类药的遗传毒性似乎不太明显。因此，从天然物质中寻找毒副作用小、安全有效的抗肿瘤药物成为近些年的研究热点。
本实验采用MTT法观察药物作用不同时间后，对HepG2细胞增殖的影响，确定生长受到明显抑制的药物起效时间。实验结果显示，复方木鸡冲剂对HepG2细胞的增殖有明显的抑制作用，但未显示出时间依赖性。在作用24h时基本上达到高峰处于稳定状态。经细胞凋亡检测证实，复方木鸡冲剂对HepG2细胞增殖的抑制作用与诱导细胞凋亡有关。
Annexin V+ /PI-双染法是检测细胞凋亡早期变化和晚期改变的方法之一。Annexin-V可以与早期凋亡时翻转到细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合[4]，PI（碘化丙啶）在细胞凋亡晚期透过细胞膜而使细胞核染成红色。Annexin V-FITC与PI联合使用，就可以将早期凋亡细胞(Annexin V+ /PI-)和晚期凋亡细胞以及坏死细胞(Annexin V+/PI+)区分开来[5]。实验结果表明，复方木鸡冲剂作用HepG2细胞24h后早期凋亡率和晚期凋亡率相当；药物作用72h后，主要表现为晚期凋亡和坏死，这一结果提示，复方木鸡冲剂诱导细胞凋亡的过程比较慢。坏死细胞百分比的增加是由于培养体系中没有吞噬细胞，凋亡的细胞最终发生了崩解。
进一步的深入研究发现，复方木鸡冲剂对HepG2细胞增殖的抑制作用还与诱导细胞分化有关。恶性肿瘤细胞在形态、功能等方面都类似于未分化的胚胎细胞，大多数学者认为失控的增殖是许多恶性肿瘤的基本特征，而肿瘤细胞诱导分化治疗是肿瘤治疗研究的新途径，其基本特点在于不单是杀伤肿瘤细胞而是诱导细胞分化为正常或接近正常细胞[6]。细胞形态是客观反映细胞分化情况的指标之一。复方木鸡冲剂处理后的HepG2细胞，由多角形转变为长梭形或树枝状，有突起伸出。细胞体积明显缩小，细胞核变小，固缩而深染，染色质凝集，核仁数目变少，肾形核多见，核浆比例降低，细胞分裂相减少，提示细胞开始恢复分化。另一方面能反映肝细胞分化的酶和蛋白[7]的测定结果显示，经复方木鸡冲剂处理后HepG2细胞分泌肝细胞增殖标志的酶GGT降低，分泌肝细胞分化标志的酶ALP增加，合成肝癌细胞的肿瘤标志物AFP减少，说明HepG2细胞经复方木鸡冲剂作用后其恶性程度明显降低。
对于复方木鸡冲剂诱导肿瘤细胞分化机理的研究我们采用了免疫细胞化学的方法测定p21WAFI蛋白表达。p21WAFI是细胞周期素依赖性激酶(CDK)的抑制因子，己知p21WAFI的表达调控与抑癌基因p53密切相关。p53蛋白的积聚，可使细胞停滞于G1晚期，目前认为p53蛋白的这种作用是通过调节p21WAFI的基因表达来实现的，p53通过与p21WAFI编码区上游的p53结合点的结合，以促进p21WAFI的表达[8]。p21WAFI可抑制CDK和PCNA，阻断细胞周期进程，在某些肿瘤细胞，p53基因突变，p21WAFI表达水平极低，导致细胞增殖失控[9]。在诱导分化研究中发现，无论哪个分化系均发现p21WAFI蛋白和mRNA增加，p21WAFI是细胞分化必需因子。实验中用复方木鸡冲剂处理HepG2细胞后发现，p21WAFI表达较空白对照组显著升高，提示复方木鸡冲剂可通过促进抑癌基因p21WAFI的表达，抑制细胞增殖，促进细胞分化。
【】
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