山东产不同农家品种瓜蒌的种子蛋白电泳分析
作者：孙稚颖， 周凤琴， 郭庆梅
【关键词】 瓜蒌；,,农家栽培品种；,,种子蛋白；,,SDS
摘要：目的：鉴定山东产瓜蒌的不同农家品种，并探讨它们的亲缘关系。方法：利用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对山东产瓜蒌的不同农家品种、野生种及湖北栝楼进行种子蛋白电泳分析，并绘制指纹图谱。结果：山东产瓜蒌不同农家品种和野生种种子的蛋白电泳图谱具有多条共有带，而与湖北栝楼图谱差异显著。结论：种子蛋白电泳分析可用于瓜蒌不同农家栽培品种的辅助鉴别，仁瓜蒌与牛心瓜蒌、小光蛋与野瓜蒌彼此间亲缘关系较近。
关键词：瓜蒌； 农家栽培品种； 种子蛋白； SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
Analysis of Seed Protein Electophoresis of Farm Cultivars of Fructus Trichosanthis from Shandong
Abstract:Objective:To determine different cultivars of Fructus Trichosanthis in Shandong, and explore their genetic relationships.Methods: SDS-polyacrylamide gel eletrophoresis was employed to analyze the seed protein of different cultivars and wild plant of Fructus Trichosanthis from Shandong and Trichosanthes hubehensis, and the finger-prints were established.Results:There were many common bands among different cultivars and wild plant of Fructus Trichosanthis, but T. hubehensis was far different from them.Conclusion:Analysis of seed protein electophoresis can be used to diagnosis farm cultivars of Fructus Trichosanthis,and there are closer relationships between Niuxin Gualou with Ren Gualou, and Xiao Guang-dan with wild sample.
Key words:Fructus Trichosanthis; Farm cultivars; Seed protein ; SDS-PAGE
蛋白质作为基因的直接稳定产物，能反映生物DNA组成上的差异，种子蛋白是植物体中一类有高强度表达，且能在种子内积累到很大量而不降解的蛋白质，其电泳谱带具有高度稳定性、专一性和叠加性。种子蛋白作为遗传标记常被用于种、属间关系、种下遗传多样性分析、品种鉴定及植物繁育系统的鉴别［1，2］。瓜蒌为传统的常用中药，具有清热涤痰、宽胸散结、润燥滑肠的功能，临床用于肺热咳嗽、痰浊黄稠、胸痹心痛、结胸痞满、乳痈、肺痈、肠痈肿痛、大便秘结等症。瓜蒌是山东著名的道地药材之一，上产量和质量均列全国之首，原植物为葫芦科栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.［3］。由于长期的栽培选育，形成了一系列的农家栽培品种；近年来，又由于一些地区和药农的盲目引种，致使瓜蒌的农家栽培品种出现混乱，甚至混种其他种类，质量变化较大，极大的影响了山东道地药材瓜蒌的生产。本实验采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，对山东道地药材瓜蒌的不同农家栽培品种、野生种以及对照湖北栝楼的种子蛋白进行了分析研究，旨为它们的分类鉴定、亲缘关系以及进一步的育种研究提供资料。
1 材料和方法
1.1 材料收集各农家品种成熟果实，取出种子，洗净晾干。供试样品来源见表1，均经山东中医药大学药学院周凤琴教授准确鉴定。
1.2 方法
1.2.1 蛋白质提取种子去种皮，称重0.1 g ，加稀释4倍的浓缩胶缓冲液（PH6.7）2 ml冰浴研磨，离心取上清液，加入等体积样品处理液，沸水浴3 min，冷却后10 000转离心5 min，4℃贮藏备用。
1.2.2 电泳［4］采用SDSPAGE法，分离胶10%，浓缩胶5%，垂直平板电泳，加样量为20μl。电极缓冲液为TrisGly（pH 8.3）系统，起始电压75 V，在指示剂进入分离胶后改为150V，恒压电泳3 h，待指示剂至胶板下沿1 cm左右停止电泳。
表1 实验材料及来源（略）
1～7号为山东产瓜蒌的农家栽培品种，原植物为栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.，8号为栝楼野生种的果实，9号为湖北栝楼Trichosanthes hupehensis C. Y. Cheng et Yueh 的果实
1.2.3 染色 将胶板浸于考马斯亮蓝染色液中，在恒温培养箱内37℃染色1～2 h，至谱带清晰，后用蒸馏水漂洗，再放入脱色液（0.5mol/L的NaCl水溶液）中约2 h，直至谱带背景清晰。
1.2.4 指纹图谱分析电泳胶板用凝胶成像紫外分析仪进行拍照，复日FR980A生物电泳图像分析系统分析，以泳道中各谱带的光密度值OD为纵坐标，谱带位置POS为横坐标绘制指纹图谱。
2 结果
瓜蒌不同农家栽培品种、野生种以及对照湖北栝楼种子蛋白电泳谱带见图1；指纹图谱见图2。由图可以看出，瓜蒌不同农家品种及野生种具有多条共有带，同时各农家栽培品种间在某些条带的有无、强弱等方面有所差异，而对照湖北栝楼与瓜蒌不同农家栽培品种及野生种在谱带数目和位置上均具有显著差异，尤其是缺少一条所有栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.及野生种都具有的强特征带。
3 讨论
3.1 种子蛋白电泳图谱为山东产瓜蒌不同农家栽培品种提供了鉴定信息。山东产瓜蒌不同农家栽培品种的种子蛋白电泳谱带具有多条共有带，表明它们具有相似的遗传基础，这也是鉴定真伪瓜蒌的重要标记。不同农家栽培品种之间在谱带数目、带的分布与强弱等方面存在着或多或少的差异，表明了各农家栽培品种遗传物质变异的不同，可用于品种的辅助鉴别。
图1 种子蛋白电泳图谱（略）
图2 种子蛋白指纹图谱（略）
3.2 山东优质农家品种瓜蒌的蛋白电泳图谱具有明显的相似性。仁瓜蒌是山东著名的优质瓜蒌农家品种，产量大质量优，药材棕红色至橙红色，果皮皱缩，果瓤及种子多，体重，糖分足。牛心瓜蒌是道地产区仁瓜蒌田内较少见的一个农家品种，果实形似仁瓜蒌，但先端渐尖，形似牛心。产区药农认为牛心瓜蒌与仁瓜蒌一样，也是优质农家品种。二者种子蛋白电泳指纹图谱具有明显的相似性，与栝楼野生种图谱的差异明显。可见通过长期的人工栽培、选育驯化，两个农家栽培品种的遗传基因在野生种的基础上发生了较大的变化，突显了植物体内的优良性状，使外观特征及内在质量等遗传性状稳定，形成了优质的农家栽培品种。
3.3 小光蛋与野瓜蒌。小光蛋是山东产区药农对栽培瓜蒌中个小色黄、类球形、果皮光滑、种子及果瓤少的一类农家品种的称呼。野瓜蒌的外形和质量极似小光蛋，在各产区民间使用。从实验结果看，小光蛋与野瓜蒌的种子蛋白质电泳指纹图谱最相似，表明亲缘关系较近。这与我们在RAPD分子标记研究中的结果相吻合。
3.4 湖北栝楼与栝楼的鉴别。湖北栝楼与栝楼是同科同属不同种植物，主产于湖北、湖南及四川。山东菏泽、泰安等地有误种，种子和根有毒，尤其是根，服后有不良反应，不宜药用［5］。种子蛋白电泳表明，湖北栝楼与瓜蒌不同农家栽培品种及野生种在谱带数目和位置上均具有显著差异，尤其是缺少一条所有栝楼都具有的强特征带，可以很容易的将其与栝楼分开。
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［1］ 胡志昂，王洪新.蛋白质多样性和品种鉴定［J］.植物学报，1991，33(7)：556564.
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