富锗灵芝菌丝体氨基酸及超氧化物歧化酶含量的测定

             作者：党建章, 孙海燕， 许柏球， 冯丽雄

【关键词】  灵芝；,,富锗；,,氨基酸；,,超氧化物歧化酶

　　摘要：目的：测定富锗灵芝菌丝体氨基酸及超氧化物歧化酶(SOD)的含量，探讨培养基中GeO2的最适加量。方法：高效液相色谱仪分析氨基酸，氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD的含量。结果：培养基中添加400 mg・L-1的GeO2，灵芝菌丝体中氨基酸含量比对照提高54.34%，SOD提高16.73%。结论：为富锗灵芝菌丝体的应用奠定基础。

　　关键词：灵芝；  富锗；  氨基酸；  超氧化物歧化酶

　　Determination of SOD and Amino Acids in Geenriched Mycelia of Ganoderma lucidum

　　Abstract:Objective:To determine the contents of SOD and amino acids in Geenriched mycelia of Ganoderma lucidum and explore the optimum dosage of GeO2 in culture medium.Methods:The contents of amino acids were analyzed by high performance liquid chromatography and SOD was determined by nitroblue tetrazolium photoreduction method.Results:Adding GeO2 400 mg・L-1 to the culture medium the contents of amino acids and SOD in Geenriched mycelia of Ganoderma lucidum increase by 54.34% and 16.73% respectively over normal mycelia of Ganoderma lucidum.Conclusion:It provides a firm foundation for application of Geenriched mycelia of Ganoderma lucidum.

　　Key words:Ganoderma lucidum；  Geenrichment;  Amino acids;  Superoxide dismutase (SOD)
   
　　灵芝（Ganoderma lucidum）是我国医药宝库中的一颗灿烂明珠，其有益心气、益肺气、坚筋骨、利关节、安神补肝等多种功用。天然灵芝含有机锗，可促进血液循环，对肿瘤、癌症有明显抑制和辅助效果，并对糖尿病、高血压、胃炎、老年痴呆患者有治疗保健作用。因此以GeO2为锗剂，通过液体深层培养获得富锗灵芝菌丝体，并对其进行深入地研究，成为近年来比较活跃的领域［1～3］。本文利用不同浓度的GeO2作为添加剂培养灵芝菌丝体，然后检测富锗灵芝菌丝体的氨基酸组成和含量及SOD的活性，以探讨GeO2对灵芝菌丝体生长及代谢的影响，为富锗灵芝菌丝体作为营养和药用的补锗剂提供。

　　1  材料与仪器

　　1.1  供试菌种 赤芝Ganoderma lucidum,AS. 565，由本院提供。

　　1.2  斜面培养基（%）马铃薯（去皮）20；葡萄糖 2；KH2PO4 0.3；MgSO4・7H2O  0.15；琼脂 2；pH 。

　　1.3  摇瓶种子和发酵培养基（%）马铃薯（去皮）20；葡萄糖2；麦麸2；蛋白胨0.5；pH自然。以上的培养基均经常规灭菌。

　　1.4  药品标准品SOD（Sigma公司），其他化学试剂均为国产分析纯。

　　1.5  仪器岛津UV-2401PC紫外分光光度计，安捷伦1100型高效液相色谱分析仪。

　　2  方法

　　2.1  摇瓶种子培养250 ml三角瓶装培养基80 ml，加4粒玻璃珠，常规灭菌，接种新鲜固体斜面菌一环（约0.5 cm2），28℃，120 r・min-1摇瓶培养至出现细小菌丝球。

　　2.2  发酵培养500 ml三角瓶装培养基100 ml，分别添加0，20，40，80，200，400，800，1 000 mg・L-1的GeO2，代号为A，B，C，D，E，F，G，H，常规灭菌，然后各接入上述种子液10 ml，28℃，100 r・min-1，培养72 h。

　　2.3  SOD酶液的制备发酵培养的菌丝体经100目筛网过滤，用0.85%NaCl溶液洗涤3次，布氏漏斗抽干，获得纯净菌丝体。称菌丝1 g，加3 ml 0.1 mol・L-1 TBE（Tris-H3BO4-EDTA）浸提液，冰浴下研磨成糊状，冷冻离心（10 000 r・min-1）10 min，取上清液（粗酶液）置冰箱内保存备用。

　　2.4  菌丝干重测定将上述酶液制备中的菌丝体80℃烘干至恒重，称重。以每升培养基中含菌丝干重表示（g・L-1）。

　　2.5  锗含量测定采用部分改进的分光光度法［4］。

　　2.6  SOD检测方法参照［5］。基本步骤为取54 ml 14.5 mmol・L-1甲硫氨酸分别加入2.25 mmol・L-1氯化硝基四氮唑蓝（NBT），60 μmol・L-1核黄素、3 μmol・L-1 EDTA各2 ml，摇匀，总体积60 ml。取7支试管,各加入上述液3 ml，再分别加入粗酶液，0，3，6，9，12，15，18 μl，混合后放在透明试管架上，25℃，4000 lx 条件下光照10 min，取出试管，迅速测定A560 nm值，以不加酶液的照光管为对照。以抑制NBT光化还原50%为一个活性单位,并以标准品SOD检测的结果校正。以每克湿菌丝所含SOD活性单位数(U)表示（U・g-1）。

　　2.7  氨基酸含量的测定准确称取上述菌丝样品细粉各100.0 mg，分别置水解管中,加6 mol・L-1 HCl 10 ml 封管，110℃水解24 h，开管后过滤，将滤液在60℃下减压蒸干，再用重蒸水洗后并蒸干,加0.1 mol・L-1 HCl定容到10 ml，上机（安捷伦1100型高效液相色谱仪）进样量为5 μl。

　　3  实验结果与讨论

　　3.1  锗标准曲线的测定准确吸取1 μg・ml-1的锗工作液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml于50 ml容量瓶中，按样品分析方法测定A值分别为：0.00, 0.051, 0.118, 0.154, 0.229, 0.268。得出回归方程y=0.054 6x+0.000 2，R2=0.993 8，绘制成图。此法测量Ge的浓度范围在0.02~0.1 μg・ml-1内线性关系良好(图略)。

　　3.2  GeO2添加量对灵芝菌丝干重、SOD、菌丝锗含量的影响在发酵培养基中添加不同浓度的GeO2，培养72 h，菌丝经处理后分别测定菌丝干重、SOD和菌丝锗含量。结果见表1。

　　表1  不同浓度GeO2对灵芝菌丝干重、SOD和菌丝锗含量的影响（略）

　　由表1可知，灵芝菌耐受GeO2的能力十分强，当GeO2加量为1 000 mg・L-1时,菌丝干重比对照（A）提高19.28%。随着培养基中GeO2量的增加，灵芝菌丝SOD的活力提高，其机理可能是GeO2可通过细胞的主动吸收而进入细胞内部，并与有机羧酸络合成锗盐，从而影响细胞某些酶类的活性变化［1］ 。但酶活力的提高与GeO2加量并不呈线性关系，原因可能是检测方法不够稳定，也可能是菌丝生长代谢的原因，有待进一步研究。

　　3.3  富锗灵芝菌丝体氨基酸含量表2显示当培养基中添加400 mg・L-1 GeO2时,灵芝菌丝氨基酸的总量可达到208.08 g・kg-1dry wt,比对照氨基酸提高54.34%,必需氨基酸的总量达到74.27 g・kg-1 dry wt, 比对照提高68.57%。组氨酸对胃、十二指肠溃疡具有作用，样品F组氨酸含量比对照提高44.26%；精氨酸具有抑制肿瘤的作用，天冬氨酸对肝病、心肌有保护作用，样品F比对照分别提高42.58%和 38.31%。从GeO2的成本、菌丝富锗量及氨基酸含量等综合考虑，笔者认为培养基中添加400 mg・L-1 GeO2较为合适。

　　表2  富锗灵芝菌丝体氨基酸含量（略）

　　：

　　［1］  陈体强，翁启勇，李开本，等.灵芝菌丝体富锗效应研究初报［J］.福建省农科院学报,1994,9（3）：4649.

　　［2］  牛建伟，谢  平.灵芝多糖锗的抗肿瘤及免疫增强作用的研究［J］.生化药物杂志,2000,21(4):189191.

　　［3］  牛君仿,王红庚,方  正，等.富锗灵芝中锗的提取方法及其分布的研究［J］.河北农业大学学报,2002,25(4)：130133.

　　［4］  袁  瑾，李雯良，钟惠民，等.分光光度法测定虫草中的锗［J］.光谱实验室, 2000，（7）：447448.

　　［5］  中国院上海植物生理研究所.植物生实验指南［M］.北京：科学出版社，1999：314315