溪黄草多糖含量测定与活性研究

【摘要】  目的研究溪黄草多糖含量及其对羟自由基的清除作用和抑菌作用。方法从溪黄草中提取精制多糖，测定出溪黄草多糖对葡萄糖的换算因子，用蒽酮?硫酸法比色测定多糖的含量；采用Fenton反应体系为模型，研究多糖对羟自由基的抑制作用；采用滤纸片法研究多糖的体外抑菌作用。结果溪黄草多糖含量为4.18%，重现性、稳定性和回收率较好；活性测试结果表明溪黄草多糖对羟自由基有较好的清除作用，对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有一定的抑菌效果。结论 溪黄草多糖含量测定方法简单可行，具有一定清除自由基和抑菌活性。

【关键词】  溪黄草；多糖；含量测定；羟自由基；抑菌作用

　　Abstract：ObjectiveTo study the content of polysaccharide from Rabdosia serra (Maxim.) Hara and its effect on hydroxyl free radical and anti?bacteriostatic effect. MethodsPolysaccharide was extracted from Rabdosia serra (Maxim.) Hara, and its content was measured by way of anthronesulphuric acid. Its inhibitory effect on hydroxyl free radical was studied by Fenton reaction system as a model. Its anti?bacteriostatic effect was also studied.ResultsThe research showed that polysaccharide content of Rabdosia serra (Maxim.) Hara reached 4.18%. It had inhibitory effect on hydroxyl free radical， staphylococcus aureus and B. subtili. ConclusionThe method of measuring polysaccharide content is simple and reliable. The polysaccharide has some activities.

　　Key words：Rabdosia serra (Maxim.) Hara；  Polysaccharide；  Content determination;  Hydroxyl free radical；  Anti?bacteriostatic effect

    溪黄草Rabdosia serra (Maxim.) Hara为唇形科香茶菜属植物，是一种多年生小草本。具有清热袪湿、凉血散淤之功效，民间用于急性肝炎、急性胆囊炎、跌打淤肿等症［1］。多糖是一类免疫活性物质，具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等作用［2～5］。目前对溪黄草多糖的研究未见报道。本文建立石油醚去脂?80%乙醇去杂?热水提取?氯仿、正丁醇去蛋白质?活性炭去色素?乙醇沉淀的提取工艺，从溪黄草中提取多糖，测得溪黄草多糖对葡萄糖的换算因子，用蒽酮?硫酸比色法测定并计算出溪黄草多糖含量，根据实验条件研究了其对羟自由基的清除作用和体外抑菌作用，期望为肇庆山区中药材的综合开发利用提供一些。

　　1  器材

　　1.1  仪器DJ?10A倾倒式粉碎机、A2004N和FA2004N天平、RE?52AA旋转式蒸发器、HH-4型数显恒温水浴锅、低温冰柜、脂肪抽出装置、电热恒温真空干燥箱、752分光光度计、UVProbe?2550型紫外可见光光度计、电热手提压力蒸气消毒器、水式热恒温培养箱。

　　1.2  材料溪黄草购于肇庆中药材市场；大肠杆菌（Escherichia coil）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Stapphy locacus aureus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、酵母菌(Yeast fungus)均由肇庆学院生物学系微生物室提供。（细菌于牛肉膏蛋白胨培养基上活化（37℃，24 h）；霉菌于查氏培养基上活化（28℃，48 h）；酵母菌于无菌水中活化（28℃，4 h）。

　　1.3  试剂蒽酮、浓硫酸、硫脲、水杨酸、过氧化氢、硫酸亚铁、无水乙醇、丙醇、石油醚、乙醚、氯仿、正丁醇等为国产分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  溪黄草多糖的提取与精制称取溪黄草粉末60 g，置脂肪抽出装置中，加入石油醚（60～90℃）250 ml，回流脱脂。滤渣挥干溶剂后，加入80%乙醇回流提取2次（1.5 h/次）。将滤渣挥干溶剂后加蒸馏水400 ml，回流提取1 h。取滤液，滤渣再加蒸馏水300 ml提1次，将两次所得滤液合并，减压浓缩至一定体积。加入氯仿?正丁醇液（4∶1）轻摇，静置取多次，除去蛋白质。水溶液中加入适量活性碳60℃保温30 min，过滤，滤液冷却后加入乙醇，使乙醇浓度达85%，放置4℃冰箱中过夜。抽滤，沉淀依次用95%乙醇、丙醇、乙醚各洗3次，真空干燥至恒重，即得精制溪黄草多糖，密封保存备用。

　　2.2  样品中溪黄草多糖含量测定

　　2.2.1 标准溶液的配制精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0.200 0 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度；摇匀，制成2.00 0 mg/ml的标准溶液，然后分别移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml标准溶液。置于10 ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀、配成系列标准溶液。

　　2.2.2  蒽酮?

　　硫酸试液的配制称取0.200 0 g蒽酮和1.00 0 g硫脲，加入100 ml浓硫酸，置于棕色瓶中，混合摇匀至暗处备用（现配现用）。

　　2.2.3  标准曲线的绘制分别准确移取系列标准溶液1 ml于具塞试管中（各平行3份），以1 ml蒸馏水作空白，各加入5 ml蒽酮试剂（立即摇匀，置冰水浴中），加完后一起沸水浴8 min，取出流水冷却，室温静置10 min，于620 nm处测定吸光值，以吸光值（A）对葡萄糖浓度（C）作回归处理，得回归方程：A=3.359C－0.011 19，r=0.999 8。

　　2.2.4  换算因子的测定精密称取2.1项下所得精制多糖10 mg，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取此液1.0 ml置10 ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度摇匀作贮备液。精密吸取贮备液2.0 ml，用标准曲线项的方法测吸光值，从回归方程中求出多糖供试液中葡萄糖浓度，按下式，测得换算因子F＝5.364。

    换算因子F=w/c×d  ［w为多糖含量（mg），c为多糖稀释液中葡萄糖浓度mg/ml，d为多糖的稀释因素］

　　2.2.5 样品溶液的制备精密称取溪黄草粉末0.5 g（过60目筛、平行3份）置三角瓶中，加80%乙醇30 ml，回流提取1 h，趁热过滤，残渣用热乙醇洗涤（8 ml×3次）。残渣连同滤纸置三角瓶中，加入40 ml蒸馏水回流提取1 h，趁热过滤，残渣用热水洗涤（8 ml×3次），洗液并入滤液中，置冷后定容于100 ml容量瓶中，摇匀备用。

　　2.2.6  样品中溪黄草多糖含量测定精密吸取样品溶液2.0 ml同

　　2.2.3项方法操作，测定供试液中葡萄糖含量。按下式计算样品中多糖的含量：多糖含量（%）＝C.D.F/W×100 ［C为供试液中葡萄糖浓度（mg/ml），D为供试液的稀释因素，F为换算因子，W为供试样品重量（mg）］。其结果见表1。表1  溪黄草中多糖含量测定结果（略）

　　2.2.7  重现性实验

　　精密称取过60目筛的溪黄草粉末0.5 g 5份，按2.2.5项方法制取5份样品溶液。精密吸取样品液2.0 ml，同2.2.3项方法测定吸光值，计算其多糖含量。结果见表2。表2  溪黄草多糖含量测定重现性实验结果（略）

　　2.2.8  稳定性实验精密吸取2.2.5项中样品溶液2.0 ml于具塞试管中，按2.2.3项方法测定吸光值，每隔1 h测定1次，连续4次考察其稳定性。结果见表3。表3  溪黄草多糖稳定性实验结果（略）

　　2.2.9  回收率的测定精密称取溪黄草粉末0.5 g 3份，各加入精制多糖20 mg，按2.2.5项样品溶液的制备和2.2.3项方法测定吸光值。计算回收率，结果见表4。表4   加样回收率测定（略）

　　2.3  溪黄草多糖活性研究

　　2.3.1  溪黄草多糖对羟自由基的清除作用将2.1项下溪黄草多糖配制成不同浓度的水溶液，采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系（8.8 mmol/L H2O21 ml， 9 mmol/L Fe2+ 1 ml, 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1ml）中分别加入一系列不同浓度的多糖液。并以蒸馏水为参比，与试剂空白液比较，在λ=510 nm处测量各浓度下的吸光度。计算被测物对羟自由基的清除作用。结果见图1。

    清除率（%）=（A0-Ax）/A0×100

　　2.3.2   溪黄草多糖的抑菌作用采用滤纸片法：将滤纸片灭菌、烘干，放到不同浓度的溪黄草多糖水溶液中浸泡2 h。将活化好的各供试菌种用无菌水分别稀释制成含菌数约1 000 cfu/ml菌悬液，于固体培养基上制成含菌平皿，放置10 min，待菌液稍渗入培养基后，每个平皿呈“+”形对称放置5片圆滤纸片，正中间的滤纸片浸双蒸水作为参照，其余4片浸多糖水溶液，每个浓度每种菌平行做4个样，每个皿做3次重复。然后把培养皿放到培养箱培养。培养结束后测定各供试菌的抑菌圈直径大小。结果见表5。表5  溪黄草多糖水溶液的抑菌效果（略）

    牛肉膏蛋白胨培养基pH为7.0；麦氏琼脂培养基、察氏培养基pH为；表中数据为3次（每次4个样）重复平行实验的平均值。

　　3  讨论

    实验2.1项中醇沉下来的白色物质，经紫外光谱检测在260～280 nm处未见到核酸和蛋白质的吸收峰；在280 nm处吸光值低于0.03，说明所提物中基本不含蛋白质杂质。经硫酸?苯酚颜色反应为棕红色，与硫酸－蒽酮试剂反应呈深绿色，证明所提物质为多糖。实验2.2.5项中首先用80%乙醇回流以除去醇溶性的干扰成分防止其成为多糖中的杂质，再用水提取多糖成分，提取效果较好。

    多糖是中草药的有效成分之一，而多糖多无法直接测定。本文利用多糖在硫酸的作用下水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与蒽酮生成深绿色化合物，以比色法测定其含量。结果表明，此方法简便，供试液显色稳定、重现性好。

    在羟自由基产生体系中加入多糖溶液时，有色产物的生成量会随着多糖浓度的增大而不断减少，即随着多糖浓度的增大清除率也增大。实验结果表明溪黄草多糖对羟自由基有一定清除作用，且与溪黄草多糖的浓度成正相关性。由于本文所采用的自由基模型体系所产生的自由基浓度远大于体内该自由基的浓度，可见它是良好的自由基清除剂。

    采用滤纸片法研究不同浓度的溪黄草多糖水溶液对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌和黑曲霉的抑菌作用。从表5中可以看出该多糖水溶液对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有一定的作用, 并且浓度越高抑菌效果越好；5.0%浓度时对大肠杆菌有作用，2.5%浓度时对面包酵母有作用，5.0%浓度时对黑曲霉有作用。

【】
  　　［1］孟艳辉. 溪黄草的化学成分研究［J］.中草药，1999，30（10）：731.

　　［2］刘卫军，李书平，何云庆，等. 植物多糖抗肿瘤活性研究进展［J］.野生植物资源，1997，16（1）：1.

　　［3］薛 明，孟宪松. 生物活性多糖的免疫研究进展与展望［J］.中兽医医药杂志，1996，3：16.

　　［4］田庚元,冯宇澄.植物多糖的研究进展［J］.中国中药杂志，1995，20(7)：441.

　　［5］钱伯钦.新兴的健康食品-多糖［J］.中国保健营养，1998，5：38.