灯盏乙素对小鼠免疫性肝损伤的保护作用

          作者：杨秀芬, 庞紫妤, 周芳, 郭菁菁, 王乃平  

【摘要】  目的观察灯盏乙素对卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)诱导的小鼠免疫性肝损伤的影响。方法给雄性小鼠尾静脉注射卡介苗( BCG,每鼠0.025 mg) ,12 d后尾静脉注射脂多糖4 μg,建立小鼠免疫性肝损伤模型,在注射LPS前,小鼠灌胃给予不同剂量的灯盏乙素(50 mg·kg–1,100 mg·kg–1),1次/d,连续12 d。测定血清丙氨酸氨基转氨酶（ALT）活性,肝脏、脾脏、胸腺指数,并进行肝脏病理组织检查。结果灯盏乙素可显著抑制免疫性肝损伤小鼠血清ALT活性, 灯盏乙素能显著降低肝损伤小鼠的肝脏指数和脾指数，减轻肝组织病理损伤程度。结论灯盏乙素对BCG＋LPS诱导的小鼠免疫性肝损伤有明显的保护作用。

【关键词】  灯盏乙素; 卡介苗; 脂多糖; 免疫性肝损伤

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of scutellarin on immune hepatic injury induced by Calmette-Guerin bacillus vaccine (BCG) and Lipopolysaccharide (LPS) in mice. MethodsExperimental immune liver injury was induced by Calmette-Guerin bacillus vaccine (BCG) in male mice by injecting via tail vein ( BCG, 0.025 mg each mouse)  Lipopolysaccharide (LPS) and LPS(4 μg each mouse) 12 d later. Scutellarin (50 mg·kg–1, 100 mg·kg–1) was given respectively, ig daily, before administration of LPS. The level of ALT in serum, organ (liver, spleen, and thymus gland) index and pathological morphological changes in liver cells were monitored. ResultsScutellarin could significantly decrease serum ALT level and liver index, spleen index,  relieve pathological damage in liver.ConclusionThese results suggested that scutellarin has markedly protective effect on immune hepatic injury induced by BCG plus LPS in mice.

　　Key words：Scutellarin;  BCG;  LPS;  Immune hepatic injury

    灯盏乙素（scutellarin）又名野黄芩苷，是灯盏花的主要有效成分［1,2］。实验发现灯盏乙素可改善脑缺血再灌注后所致的肝功能损伤，其机制是降低血中一氧化氮（NO）水平和黄嘌呤氧化酶活性、升高肝胞浆中的抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物还原酶(GSH-Px)和谷胱甘肽转移酶的活性［2］。另有研究表明: 灯盏乙素可抑制Fe-Vc诱导的大鼠肝线粒体氧化损伤, 通过诱导肝组织中的抗氧化酶SOD，过氧化氢还原酶（CAT）及GSH-Px, 清除氧自由基, 降低肝组织中的丙二醛(MDA),有效抗硒所致的肝脏损伤［3］。但灯盏乙素对由卡介苗（BCG）和脂多糖（LPS）所致的免疫性肝损伤的作用未见报道。本研究通过对小鼠进行血清丙氨酸氨基转氨酶（ALT）的测定、肝指数、脾指数、胸腺指数及肝组织病理切片来考察灯盏乙素对由卡介苗（BCG）和脂多糖诱导的免疫性肝损伤是否具有保护作用。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  动物昆明种雄性小鼠，体重 17～23 g，SPF级, 购自广西壮族自治区食品药品药检所。动物合格证：SCXK桂2003－001号。

　　1.1.2  药品与试剂

　　灯盏乙素（98.81% ）购自云南玉溪万方天然药物有限公司，批号：051202；皮内注射用卡介苗（Calmette Guerin bacillus vaccine,BCG）（5人份/支）购自生物技术集团公司上海生物制品研究所，批号：200503090；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) 购自Sigma公司，批号：L2880；联苯双酯滴丸购自广州星群（药业）股份有限公司，批号：CF40090；丙氨酸氨基转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）测定试剂盒购自南京建成生物制品研究所，批号:20060419 。

　　1.1.3  仪器

　　Agilent  8453紫外分光光度计仪 ；德国赛多利斯分析天平；高速低温离心机（德国Biofuge Stouctos 公司）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  小鼠免疫性肝损伤模型的复制方法［5,6］

　　采用卡介苗 (BCG) 加脂多糖 (LPS) 诱导小鼠免疫性肝损伤模型。给每只小鼠尾静脉注射BCG 0.025 mg,致敏后12 d,再注射 LPS 4 μg攻击,以诱导肝损伤,12 h后,再处死,测定各项指标。

　　1.2.2  给药方法

　　动物按体重分层随机分为5组:正常对照组、免疫模型组、联苯双酯组（200 mg·kg–1）、灯盏乙素(50 mg·kg–1、100 mg·kg–1)小、大2个剂量组。除正常组外,其余4组小鼠均于实验的第1天,按上述的实验方法给予BCG,联苯双酯组和灯盏乙素小、大2个剂量组均于造模的第1天（给BCG 3 h后）,按上述剂量灌胃给药,灌胃1次/d,连续12 d,容量为 0.2 ml·（10 g）-1,正常组及免疫模型组均灌胃等容量的蒸馏水。在注射LPS攻击后12 h,小鼠眼眶取血,分离血清待测,并迅速取出肝、脾和胸腺。

　　1.2.3  肝、脾、胸腺指数测定

　　采血前称小鼠体重,采血后颈椎脱臼处死小鼠,取肝、脾、胸腺称重，肝、脾、胸腺指数。脏器指数=脏器重(mg)/体重（g）。

　　1.2.4  血清酶活性测定血清ALT活性,采用赖氏法，按试剂盒所述方法操作，蒸馏水调零，每一样品均用自身血清作对照，用Agilent 8453紫外分光光度计仪于505 nm波长处测吸光度值，制定标准曲线，换算成ALT卡门氏单位。

　　1.2.5  肝组织病观察取各组小鼠肝右叶,10％甲醛固定,石蜡包埋,切片, HE染色。光镜下观察各组肝脏组织病理变化情况。

　　1.2.6  统计学方法计量数据采用 ±s,组间比较进行t检验，数据采用Microsoft Excel统计软件进行分析处理。

　　2  结果

　　2.1  灯盏乙素对免疫性肝损伤小鼠脏器指数的影响

　　免疫模型组的肝脏指数、脾脏指数明显增大,与正常对照组相比,有显著性差异( P < 0. 01)。而灯盏乙素50 mg·kg–1 、100 mg·kg–1 两个剂量均能显著降低肝损伤小鼠的肝脏指数和脾指数( P < 0. 05～0. 001)，灯盏乙素大剂量(100 mg·kg–1 )能非常显著降低脾脏指数( P < 0. 001) 。但灯盏乙素50，100 mg·kg–1 两个剂量对小鼠的胸腺指数没有影响。结果见表1。表1  灯盏乙素对BCG＋LPS所致免疫肝损伤小鼠脏器指数的影响(略)

　　2.2  灯盏乙素对小鼠血清ALT的影响

　　免疫性肝损伤模型组小鼠,血清ALT明显升高,与正常对照组比较,P<0. 01,说明模型建立成功。灯盏乙素50，100 mg·kg–1两个剂量均可显著降低免疫性肝损伤小鼠血清ALT,与模型组比较, P< 0. 05。100 mg·kg–1的灯盏乙素的降酶效果与200 mg·kg–1的联苯双酯相同。结果见表2。表2  灯盏乙素对BCG＋LPS所致肝损伤小鼠血清ALT的影响(略)

　　2.3  灯盏乙素对肝脏病理组织学的影响

　　对照组肝细胞结构正常,肝细胞索清晰,围绕中央静脉呈放射状排列（见图1）;模型组（肝损伤组）可见肝小叶排列不齐,胞浆疏松,大部分细胞浊肿变性,有气球样变，散在炎性细胞浸润（见图2）,与肝损伤组比较, 灯盏乙素大剂量组和联苯双酯组病理改善明显, 肝小叶仍排列整齐，浊肿变性轻微，炎性细胞明显减少(见图3～4)。灯盏乙素小剂量组的损伤程度也有所改善。结果见图5。

　　3  讨论

    一般可采用四氯化碳、硫代乙酰胺、D-氨基半乳糖等化学因素所致小鼠肝损伤模型和由BCG（卡介苗）和LPS（脂多糖）诱导的小鼠免疫性肝损伤模型来筛选抗肝炎药物，但四氯化碳、硫代乙酰胺、D-氨基半乳糖等化学因素所致小鼠肝损伤模型在致病机制与病理改变上与临床多数肝炎有较大距离,也不适用于具有免疫调节作用的护肝药的药效评价,而免疫系统在肝炎的发病过程中有重要作用,尤其是慢性肝炎、肝硬化、乙醇中毒性及药物性肝损伤［7～9］。注射微量的BCG（卡介苗）和LPS（脂多糖）即可诱导小鼠免疫性肝损伤,此型肝损伤模型类似于人类肝炎发生的病理生理过程,是筛选保肝药物较为理想的模型［7～9］。因此,本实验用BCG（卡介苗）和LPS（脂多糖）复制小鼠免疫性肝损伤模型,并研究了灯盏乙素对小鼠免疫性肝损伤的作用。实验结果表明, 用BCG（卡介苗）和LPS（脂多糖）诱导的小鼠免疫性肝损伤模型,其模型鼠的血清ALT活性明显升高,肝脏、脾脏明显肿大,病理切片显示肝小叶结构破坏，肝细胞浊肿变性明显。说明本实验所建立的肝损伤模型成功。

    灯盏乙素是灯盏花提取物的主要有效成分，为一活性单体黄酮化合物［1，2］。本实验观察到灯盏乙素能使免疫性肝损伤模型小鼠血清ALT的活性明显降低,肝脏指数、脾脏指数显著下降;低剂量(50 mg·kg–1)的灯盏乙素就能显著减轻肝损伤模型小鼠的肝、脾脏指数;并且显示出随着剂量的增加而增强。此外, 灯盏乙素能显著减轻模型鼠肝脏的病理损伤。 从对病理损伤的改善程度和降酶效果来看，100 mg·kg–1的灯盏乙素与 200 mg·kg–1的联苯双酯基本相同。以上表明灯盏乙素对BCG加LPS诱导的小鼠免疫性肝损伤有明显的保护作用。这为临床应用灯盏乙素免疫性肝炎提供了一定的药理学依据。

【】
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