注射用盐酸头孢甲肟含量测定及有关物质检查方法的研究

            作者：李群力 刘家健 黄金龙 游莉 施存元

【摘要】  目的 用HPLC法测定注射用盐酸头孢甲肟中头孢甲肟的含量及有关物质。方法 采用ODS C18(200mm×4.6mm，5μm)色谱柱，流动相采用水∶冰乙酸∶乙腈(850∶17∶150)，流速1.0ml/min，检测波长254nm。结果 溶液浓度在0.06～500μg/ml范围内线性良好，r=0.9997(n=12)，方法平均回收率为99.87%，RSD为0.36%(n=9)。盐酸头孢甲肟杂质数目为14至15个，总量为1.00～1.58%。结论 本法简便、准确、灵敏度高，可用于注射用盐酸头孢甲肟的含量和有关物质检查，亦可以进行稳定性研究中降解产物的色谱检查。

【关键词】  盐酸头孢甲肟 注射液 含量测定 关物质 HPLC

    Determination of cefmenoxime hydrochloride for injection

      ABSTRACT  Objective  To develop a method for the determination of cefmenoxime hydrochloride for injection and it′s related substances by HPLC.  Method  Samples were analyzed on an ODS C18 column with mobile phase of water∶glacial acetic acid∶acetonitrile (850∶17∶150) at flow rate 1.0ml/min and detection wavelength of 254nm.  Result  The standard curves were linear in the range of 0.06～500μg/ml (r=0.9997). The average recovary was 99.87% (RSD=0.36%). The number of related substances in cefmeno?xime hydrochloride is 14～15 and the total amount is 1.00%～1.58%.  Conclusion  The method is simple, accurate and suitable for the determination of cefmenoxime hydrochloride and it′s related substances. It can also be used to analyzed degradation products in the stability experiments.

    KEY WORDS  Cefmenoxime hydrochloride;  Injection;  Content determination;  Related substances; HPLC

　  注射用盐酸头孢甲肟为头孢菌素类抗感染药［1］，是盐酸头孢甲肟加适量助溶剂无菌碳酸钠制成的粉针剂［2］。盐酸头孢甲肟为有效成分，对光、湿敏感，其中可能存在的杂质有原料7?氨基?3?［(1?甲基?1H?四唑?5?基)硫甲基］头孢烷酸盐酸盐(简称7?ATCA·HCl)、1?甲基?5?巯基?四氮唑(简称MMTZ)和7?氨基?头孢烷酸(简称7?ACA)等。不考虑采用容量法进行含量测定，而参照美国药典24版，选用灵敏度高、专属性强的高效液相色谱法(HPLC)作为含量测定和有关物质测定方法，以确保本品质量［3］。

1  仪器与试药

    1.1  仪器

    日本岛津公司LC?6A高效液相色谱仪，附有SPD?6AV紫外分光光度检测器，C?R3A色谱数据处理机，20μl自动进样阀。

    1.2  试剂

    冰乙酸(无锡阳山生化有限责任公司)、乙腈(上海诚心化工有限公司)、磷酸盐(株州市中天磷酸盐化工有限责任公司)，均为GR级。

    1.3  对照品

    头孢甲肟对照品由药品生物制品检定所标定，批号20030118，头孢甲肟含量93.5%。

    1.4  样品

    注射用盐酸头孢甲肟为自制，每瓶1.0g，批号20030203、20030204和20030205。

    2  方法和结果

    2.1  色谱条件

    Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流动相为水∶冰乙酸∶乙腈(850∶17∶150)；流速1.0ml/min；检测波长254nm；灵敏度0.1Aufs；进样体积20μl；理论塔板数以头孢甲肟计不低于4962。

    2.2  对照品溶液的制备

    (1)含量测定  精密称取对照品10mg，置50ml的容量瓶中，加0.1mol/L pH6.8的磷酸缓冲液(0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀)2ml溶解，再加流动相制成每1ml中含0.2mg头孢甲肟的对照品溶液，摇匀，备用。

    (2)有关物质检查  精密称定供试品10mg，加0.1mol/L pH6.8的磷酸缓冲液2ml溶解，再加流动相制成每1ml中含0.2mg的供试品溶液；另取供试溶液2ml置100ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

    2.3  供试品溶液的制备

    (1)含量测定  精密称取供试品约相当于头孢甲肟10mg，置50ml的容量瓶中，加0.1mol/LpH6.8的磷酸缓冲液2ml溶解，再加流动相制成每1ml中含0.2mg头孢甲肟的供试品溶液，摇匀。

    (2)有关物质检查  取本品适量，用流动相配制系列浓度，在盐酸头孢甲肟与相邻杂质达到中国药典2005年版二部附录VD分离度要求的前提下进行杂质检查供试液浓度的确定试验。结果表明，在250～100μg/ml(进样体积20μl)时，检出杂质的个数和百分含量(峰面积)变化不大，因此将200μg/ml作为有关杂质检查的供试液浓度。

    2.4  测定方法

    (1)含量测定方法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积(图1)，按外标法。

    (2)有关物质检查方法  取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰的高度达记录仪满标度的10%。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的两倍。供试品溶液色谱图中如显杂质，量取各杂质峰面积之和，不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍(3.0%)。

    图1    注射用盐酸头孢甲肟含量测定图谱

    2.5  标准曲线及线性范围

    (1)含量测定  精密称取对照品制成浓度分别为25、50、100、125、250和500μg/ml的供试液，分别进样20μl，测定。以峰面积(Y)对浓度(X)绘制回归曲线，经回归分析得回归方程：

    Y=44693.17619X-55001.48582  r=0.9997

    其浓度在范围0.06～500μg/ml内线性关系良好。最低检出量为0.0012μg。

    (2)有关物质检查  7?ACA和MMTZ用2ml 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)溶解，再用流动相配制并稀释成浓度为6、3、1.5、0.3、0.15、0.075和0.038μg/ml；7?ATCA·HCl用0.5%碳酸钠超声溶解成4mg/ml的溶液，用水稀释成1mg/1ml的溶液，再用流动相稀释成上述浓度，分别进样20μl测定，以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，7?ACA、MMTZ和7?ATCA·HCl三种杂质的回归方程分别为：

    Y=235252.50923X-1271.07280  r=0.9999

    Y=31534.31999X-4501.760778  r=0.9996

    Y=79457.54682X+3014.548632  r=0.9996

    试验表明，上述三种杂质的进样量与峰面积的相关性良好，检出灵敏度分别为0.125、5和0.125ng。

    2.6  稳定性试验

    为避免溶剂峰的存在造成峰面积百分率上的麻烦，选用流动相配制杂质检查用供试品溶液，精密吸取对照品溶液20μl，每隔30min进样20μl，测定Y值。结果表明本品的供试溶液不稳定，在不到2h内杂质含量由1.00%增加为1.42%，因此，有关物质检查供试液必须新鲜配制。

    2.7  精密度试验

    对同一供试品溶液进行数次测定，按峰面积计算进样精密度试验，同一样品当日数次称量或不同日期称量测定，按百分含量计算进行日内和日间测定方法精密试验，日内精密度、日间精密度的RSD%分别为0.42%和0.71%，表明方法的精密度能满足含量测定要求。

    2.8  回收率试验

    按标示量的80%、100%和120%计算，精密称定对照品适量，分别加入注射用盐酸头孢甲肟的空白辅料22mg，分别用流动相稀释至刻度，混匀直接进样20μl，按外标法计算回收率。结果见表1。回收率试验结果表明，空白辅料对其含量测定无干扰。

    2.9  专属性试验

    经碱破坏、酸破坏、热破坏、强光照射和pH6.8缓冲液中的降解等试验，结果表明头孢甲肟峰与前后相邻杂质峰能完全分离，对本品的含量测定不干扰。

    2.10  样品含量及有关物质测定结果

    精密吸取样品溶液20μl，进样测定，盐酸头孢甲肟杂质数目为14至15个，总量为1.00%～1.58%，结果见表2。表1      注射用盐酸头孢甲肟回收率试验表2    样品含量及有关物质测定结果

    3  小结

    (1)本文所用的HPLC方法可用于盐酸头孢甲肟产品的含量测定(表2)。

    (2)本方法亦可进行盐到头孢甲肟产品的有关物质检查。盐酸头孢甲肟的杂质有三种：原料7?氨基?3?［(1?甲基?1H?四唑?5?基)硫甲基］头孢烷酸盐酸盐、1?甲基?5?巯基?四氮唑和7?氨基?头孢烷酸，共形成14～15个杂质峰。

    (3)本方法还能作为本品稳定性研究中降解产物的检查方法。

    (4)本文所用测定含量和有关物质的HPLC方法的检测波长(254nm)和流速(1ml/min)与USP24版一致，区别在于USP24版所用流动相为水∶乙腈∶冰乙酸(50∶10∶1)，本文所用流动相为水∶冰乙酸∶乙腈(850∶17∶150)；USP24版中的理论塔板数以头孢甲肟计不小于1200，本文则不小于4962。本方法对国产头孢甲肟的测定更准确，灵敏度更高。

    (5)本文所用HPLC法测定盐酸头孢甲肟的含量，同微生物效价测定法比较，后者测定条件要求较高，测定比较繁琐且准确度差；HPLC法则方便、准确，精密度高。

    (6)本研究建立的注射用盐酸头孢甲肟中头孢甲肟含量和有关物质的测定方法，能有效控制成品质量，为成品质量标准的建立提供了依据。

【】
  ［1］ Stamm J M, Girolami R L, Shipkowitz N L, et al. Antimicrobial activity of cefmenoxime (SCE?1365) ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1981,19(2):454

［2］ Huang J L, Ying W, Shi C Y, et al. The preparation process of domestic cefmenoxime hydrochloride ［J］. Chin J Antibioti(抗生素杂志),2005,30(7):396

［3］ The United States Pharmacopeial Convention. USP XXIV, NF18 ［S］. 2000:331