大肠埃希菌产PER?1型超广谱β?内酰胺酶的研究
【摘要】 目的 检测大肠埃希菌产PER?1型超广谱β?内酰胺酶的发生率及其耐药特点。方法 采用双纸片增效确证试验进行超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)的表型检测，对表型阳性菌株用聚合酶链反应(PCR)和PCR产物测序方法确定超广谱β?内酰胺酶的基因型。结果 167株大肠埃希菌中有50株产ESBLs，占29.9%(50/167)；6株产PER?1型ESBLs，占3.6%(6/167)。6株产PER?1型ESBLs大肠埃希菌均对头孢他啶和头孢噻肟耐药，5株对头孢西丁耐药，4株对阿米卡星敏感，全部菌株对亚胺培南敏感。结论 大肠埃希菌中检测到产PER?1型超广谱β?内酰胺酶，且其耐药和多重耐药性严重，应引起重视。
【关键词】 大肠埃希菌 PER?1 β?内酰胺酶 耐药基因型
Study on PER?1 type extended?spectrum β?lactamase produced
ABSTRACT Objective To investigate the prevalence of PER?1 type extended spectrum β?lactamases (ESBLs) and its antimicrobial?resistance profile in Escherichia coli. Methods One hundred and sixty?seven strains of Escherichia coli were tested. All of them were isolated from all kinds of clinical specimens from four hospitals of Nanchang city from August 2002 to June 2003. Antimicrobial susceptibility tests (AST) were determined by Kirby?Bauer disk diffusion test. Double?disk test and three?dimension extraction test were used to determine ESBLs. blaPER?1 genes were amplified by PCR. The products of PCR were sequenced to identify the β?lactamase genotype. Results The positive rates of ESBLs in Escherichia coli were 29.9% (50/167). Six isolates carried blaPER?1 gene. The blaPER?1 gene positive rates of Escherichia coli is 3.6% (6/167). Among 6 isolates carring blaPER?1, all were resistant to cefotaxime and ceftaxidime, 2 resistant to amikacin, 5 resistant to cefoxitin and all sensitive to imipenem. Conclusion PER?1 β?lactamases and their encaling genes are detected in Escherichia coli. The isolates harbouring blaPER?1 are resistant to many antibiotics.
KEY WORDS Escherichia coli; PER?1; β?lactamases; Resistance genotype收稿日期：2006?04?18
大肠埃希菌是临床常见病原菌，特别是其高产超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)及多重耐药性己引起临床广泛关注，产ESBLs大肠埃希菌株不断增多，且可通过质粒造成耐药性的跨菌种播散，对感染构成严重威胁。1993年Nordmann等首次从法国分离的铜绿假单胞菌中检出PER?1型ESBLs，1997年Vahaboglu等［1］在土耳其的一次普查中发现72株不动杆菌中有33株产PER?1型ESBLs， 检出率达45.8%，2002年我国蒋晓飞等［2］在鲍曼不动杆菌中检出PER?1型ESBLs。目前，关于肠杆菌科细菌产PER?1型ESBLs研究较少。我们对南昌地区2002年8月～2003年5月临床分离到的167株大肠埃希菌进行了PER?1型ESBLs基因型的检测，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
(1)试验菌株和质控菌株 收集2002年8月～2003年5月江西医学院第一附属医院、第二附属医院、江西省人民医院和南昌市第一人民医院临床标本中分离到的大肠埃希菌167株；质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、产SHV?18型ESBLs肺炎克雷伯菌ATCC700603、产PER?1型ESBLs鲍曼不动杆菌(上海瑞金医院倪语星教授惠赠)。
(2)抗生素药敏纸片 亚胺培南(IMP)、头孢吡肟(CPE)、头孢西丁(CFX)、头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟/克拉维酸(CTX/CA)、头孢他啶(CAZ)、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CA)(购自Oxoid公司)；氨苄西林(ABPC)、阿奇霉素(AZM)、环丙沙星(CPLX)、克林霉素(CLDM)、氨曲南(AZ)、呋喃妥因(NFT)、阿米卡星(AMK)购自北京天坛药物生物技术开发公司。
(3)PCR引物 由上海博亚生物公司合成，序列如下：
blaTEMA：5′?GAGTATTCAACATTTCCGTGTC?3′
blaTEMB：5′?TAATCAGAGAGTGAGGCACCTAT?
CTC?3′
blaSHVA：5′?TGGTTATGCGTTATATTCGCC?3′
blaSHVB：5′?GCTTAGCGTTGCCAGTGCT?3′
blaPER?1A：5′?AATTTGGGCTTAGGCTTAGGG?
CAGAA?3′
blaPER?1B：5′?ATGAATGTCATTATAAAAGC?3′
blaVEB?1A：5′?CGACTTCCATTTCCCGATGC?3′
blaVEB?1B：5′?GGACTCTGCAACAAATACGC?3′
(4)主要仪器 Vitek?32全自动微生物分析仪(法国Bio?Merieux公司)、PCR扩增仪(美国PE公司)、双向电泳分析仪(美国Bio?Rad公司)、Tanon凝胶成像系统(上海天能公司)。
1.2 方法
(1)菌株鉴定及药敏试验 所有菌株分别由各单位的全自动微生物分析仪进行鉴定，接种至半固体培养基，-20℃保存。药敏试验由本室采用纸片扩散法集中测定，严格按照美国国家临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)的标准判断结果，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
(2)ESBLs表型确证试验 分别将头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟/克拉维酸(CTX/CA)、头孢他啶(CAZ)、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CA)药敏纸片贴于涂有被测菌的MH平板上，35℃孵育16～18h观察结果，若CAZ/CA比CAZ或CTX/CA比CTX的抑菌环大于或等于5mm以上即为ESBLs阳性，确证试验符合CLSI/NCCLS2001年(M100?S11 2001)规定的方法。
(3)DNA模板制备 取已分纯的菌落２～3个，加入100μl PBS缓冲液中，制备浓菌液。用PBS缓冲液洗涤2次，煮沸15min，释放DNA。
(4)PCR扩增耐药基因 PCR反应总体积为50μl，其中引物1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTP(200μmol/μl)1μl，Mg2+ 2.5mmol/L，Taq酶2.5μl，DNA模板2μl，双蒸水38.5μl。扩增条件为：94℃初变性4min，然后94℃变性45s，退火温度blaTEM为57℃，blaSHV为55℃，blaPER?1为50℃，blaVEB?1为55℃，时间为30s，72℃延伸45s，进行25个循环最后延伸10min，PCR产物在0.7%的琼脂糖凝胶中进行电泳后，用凝胶成像系统观察结果。
(5)PCR产物测序 PCR扩增原液经上海博亚生物公司纯化后，用ABIPRISM377DNA测序仪进行正反双向测序，测序结果在GenBank中经BLAST标准核酸?核酸程序和核酸?蛋白质程序分析，以确定基因型别。
2 结果
2.1 大肠埃希菌产ESBLs的情况及PER?1型ESBLs发生率
经表型确证试验检测，167株大肠埃希菌中有50株ESBLs阳性，占29.9%(50/167)，其中50株ESBLs阳性菌株经PCR扩增有6株检出blaPER?1基因，占产ESBLs阳性菌的12.0%(6/50)，占总检出菌株的3.6%(6/167)。
2.2 50株ESBLs阳性大肠埃希菌株的耐药特点
50株ESBLs阳性菌株对氨苄西林和阿奇霉素全部耐药，49株对克林霉素耐药，耐药率为98.0%，对头孢噻肟的耐药率(92.0%)明显高于对头孢他啶的耐药率(64.0%)，对氨曲南、头孢西丁、环丙沙星、阿米卡星的耐药率分别为86.0%、62.0%、64.0%和42.0%，对呋喃妥因的耐药率(16.0%)相对较低，全部菌株对亚胺培南敏感(表1)。
2.3 PER?1型ESBLs菌的耐药特点
6株产PER?1型ESBLs菌株对头孢噻肟和头孢他啶均耐药，其中有4株产酶株对头孢噻肟抑菌环直径大于对头孢他啶抑菌环直径，1株两种药物的抑菌环都为6.5mm，仅1株产酶菌对头孢噻肟的抑菌环直径小于对头孢他啶的抑菌环直径，有5株产酶株对头孢西丁耐药，4株对阿米卡星敏感，全部菌株对亚胺培南敏感，也未发现中介菌株(表2)。
2.4 基因序列测定结果
blaPER?1基因扩增产物经测序为579bp的基因片段，经GenBank BLAST程序标准核酸→核酸分析，与PAPERIA序列594～1172之间的579bp 100%符合，全部位于来源于铜绿假单胞菌的PAPERIA基因序列表1 50株大肠埃希菌对11种抗生素的耐药率表2 6株产PER?1型ESBLs大肠埃希菌对CPE≥18mm，AMK≥17mm，CFX≥18mm，IMP≥16mm。的开放读码框内(228～1211bp)。经核酸→蛋白质程序翻译成氨基酸序列，共含有193个氨基酸，与PAPERIA的氨基酸序列的14～206之间的193个氨基酸100%符合，绝大部分位于蛋白质的核心区域内，PAPERIA氨基酸序列的1～26位氨基酸为信号肽，本研究的blaPER?1基因的推断序列的第一个氨基酸正好位于信号肽的中间。推断出的氨基酸序列包含A类酶的特征，确定为PER?1型ESBLs，PCR结果见图1。
3 讨论
大肠埃希菌是临床常见菌，尤其是近年来临床上多重耐药大肠埃希菌的不断增多，己引起临床的普遍关注。大肠埃希菌对β?内酰胺类药物的主要耐药机制是产生了能水解β?内酰胺环的超广谱β?内酰胺酶。超广谱β?内酰胺酶主要由TEM?1、TEM?2和SHV?1型广谱β?内酰胺酶经几个氨基酸点突变而来，能水解包括第三代头孢菌素在内的β?内酰胺类药物，不水解头霉素、碳青霉烯类抗生素，其活性可被克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦等酶抑制剂抑制。最近20年，由于第三代头孢菌素的大量使用，产ESBLs的大肠埃希菌越来越多。目前为止已检出100余种ESBLs。除TEM型和SHV型ESBLs外，还有CTX?M型、PER型、VEB型等ESBLs。PER?1型ESBLs是非TEM型和非SHV型ESBLs，1993年Nordmann等［3］首次从法国分离的铜绿假单胞菌中检出PER?1型ESBLs，其后相继在鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形菌、沙门菌属等检出PER?1型ESBLs。首先在土耳其，几年后在意大利、英国等国家也检出PER?1型ESBLs［4］；1997年Vahabogblu等在一次普查中发现不动杆菌属PER?1型ESBLs的检出率高达45.8%。2002年以前在欧洲以外的国家都没有检出PER?1型ESBLs，2003年韩国从不动杆菌中检出PER?1型ESBLs，检出率高达52.0%［5］。我国蒋晓飞等于2002年首次从上海瑞金分离的一株鲍曼不动杆菌中检出PER?1型ESBLs，2003年候天文等［6］也报道从126株铜绿假单胞菌中检出14株blaPER?1基因阳性菌株。以往PER?1型ESBLs主要在非发酵菌中检出，但PER?1型ESBLs由质粒编码，具有跨菌种跨地区播散的能力，肠杆菌科细菌产PER?1型ESBLs情况如何，我国研究较少。我们对临床分离到的167株大肠埃希菌进行了检测。共检出6株blaPER?1基因阳性株，占产ESBLs阳性菌的12.0%(6/50)，占总检出菌株的3.6%(6/167)。研究结果显示PER?1型ESBLs己向肠杆菌扩散，应引起重视。
PER?1型ESBLs对头孢他啶的耐药率明显高于非PER?1型ESBLs，6株产PER?1型ESBLs菌对头孢他啶均耐药，有5株菌对头孢他啶的抑菌环直径小于对头孢噻肟的抑菌环直径，这一点与CTX?M型ESBLs对头孢噻肟的抑菌环小于头孢他啶有所不同，CTX?M型主要对头孢噻肟耐药而对头孢他啶通常敏感［7］，所以在筛选产PER?1型ESBLs株时最好同时使用头孢噻肟和头孢他啶，对两种抗生素同时耐药的菌株可高度怀疑产PER?1型ESBLs，国外多用头孢他啶耐药而哌拉西林敏感作为产PER?1型ESBLs的筛选标准［8］。Minoz等［9］在动物试验中发现阿米卡星和亚胺培南产PER?1型ESBLs菌引起的肺炎时，具有良好的效果，且阿米卡星对第三代头孢菌素和亚胺培南都具有协同作用，治疗产PER?1型ESBLs菌引起的感染最佳药物为亚胺培南和阿米卡星联合用药。本研究检出产PER?1型ESBLs的大肠埃希菌体外抗菌试验对亚胺培南全部敏感，也证实亚胺培南为最佳治疗药物，其次为阿米卡星。
我国产PER?1型ESBLs己在鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及肠杆菌科中细菌检出，且有其独特的耐药特点，应引起重视，加强检测，防止由该类细菌引起的医院感染流行。
【】
［1］ Vahaboglu H, Ozturk R, Aygun G, et al. Widespread detection of PER?1?type extended?spectrum β?lactamase among nosocomial Acinetobacter and Pseudomonas aeruginosa isolates im Turkey: a nationwide multicenter study ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1997,41(10):2265
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