HPLC法测定阿奇霉素散剂的含量

【摘要】  目的 建立HPLC法测定阿奇霉素散剂的含量。方法 采用C8柱，以0.045mol/L磷酸二氢胺溶液∶乙腈(2∶1)(用三乙胺调pH至7.35)为流动相，流速1ml/min，检测波长210nm，柱温40℃。结果 阿奇霉素的线性范围为50.3～1006μg/ml，平均回收率100.1%，r=1.0000，RSD=0.8%(n=9)。结论 HPLC法测定结果与微生物检定法比较无显著性差异。本方法可准确、快速、简便地测定阿奇霉素散剂的含量。

【关键词】  高效液相色谱法； 阿奇霉素散剂； 含量测定

　　Content determination of azithromycin powder by HPLC   
　　ABSTRACT  Objective  To establish an HPLC method for the determination of azithromycin powder.Method  The chromatographic conditions were as followed: C8 column, 0.045 mol/L ammonium phosphate monobasic solution∶acetonitrile (2∶1) (adjusted to pH7.35 with triethylamine) as mobile phase, temperature: 40℃, the flow rate: 1.0 ml/min, detection wavelength: 210nm.  Results  The linear range was in therange of 50.3～1006μg/ml (r=1.0000), and the mean recovery (n=9) was 100.1% (RSD=0.8%).Conclusion  The method is rapid, simple and accurate to determine the content of azithromycin powder.
  
　　KEY WORDS  HPLC;  Azithromycin powder;  Content determination

　　阿奇霉素为氮杂内酯类抗生素，日抗基和《药典》2005年版［1］均采用微生物检定法测定其含量，《欧洲药典》4.6版和USP26版中均采用HPLC法，专属性较强，试验周期短，但均使用的是聚合物极性柱，《欧洲药典》柱温为70℃，USP采用电化学检测器，其采用的设备在我国药检部门尚未普及［2］。抗生素微生物检定法操作较为复杂，试验周期长，影响因素多，误差较大。本文采用HPLC法测定阿奇霉素散剂含量，可使阿奇霉素与其有关物质得到较好的分离，方法简便、快速、准确。

　　1  仪器与试药
   
　　Aglient 1100高效液相色谱仪/DAD检测器，Aglient化学工作站。试药：阿奇霉素对照品(130352?200304，946u/mg)及红霉素对照品(130307?200215，923u/mg)均由中国药品生物制品检定所提供； 阿奇霉素散剂规格为0.25g(以阿奇霉素计，批号030601，030602，030603)由安徽安科药业股份有限公司生产；纯化水，乙腈(色谱纯)，磷酸二氢铵(分析纯)。

　　2  色谱条件
   
　　色谱柱：Eclipse XDB?C8柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：0.045mol/L磷酸二氢铵溶液∶乙腈(2∶1)(用三乙胺调pH至7.35)；流速：1ml/min，检测波长：210nm，柱温：40℃。在上述色谱条件下，十六醇、蔗糖等辅料、阿奇霉素对照品、供试品及阿奇霉素与红霉素对照品溶液的色谱图见图1。

　　3  方法与结果

　　3.1  方法的专属性考察
   
　　精密称取阿奇霉素对照品20mg，分别置10ml容量瓶中，进行如下破坏试验：①酸破坏：加入0.1mol/L的盐酸溶液溶解并稀释至刻度， 室温放置2h； ②碱破A：辅料空白；  B：阿奇霉素对照品；  C：供试品；  D：阿奇霉素与红霉素对照品(1：阿奇霉素；  2：红霉素)

　　图1    HPLC色谱图　略

　　坏：加入0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度，制成约2mg/ml的溶液，室温放置2h；③氧化破坏：加入5%双氧水溶解并稀释至刻度，室温放置2h；④热破坏：60℃加热破坏6h，加流动相溶解并稀释刻度。按上述色谱条件进样记录图谱(图2)，结果表明阿奇霉素对热较稳定，其它条件均不稳定，破坏产生的各相关杂质峰与主峰均能基线分离，说明该色谱条件能准确测定阿奇霉素的含量。

　　3.2  线性关系
   
　　精密称取阿奇霉素对照品，加流动相溶解并稀释，摇匀，制成2mg/ml的储备液。精密量取储备液0.5、1、2.5、5、10ml分别置于10ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下分别进样20μl，每一组浓度进样3次，记录峰面积。以阿奇霉素素对照品浓度x(μg/ml)对色谱峰面积y绘制标准曲线，其回归方程为：y＝0.4791x-1.7562  r=1.0000　结果表明，阿奇霉素浓度在50.3～1006μg/ml范围内呈良好线性关系。

　　3.3  进样精密度
   
　　对同一份对照品溶液，连续进样6次，按上述色谱条件测定峰面积，RSD为0.07%。

　　3.4  稳定性试验
   
　　取上述溶液分别放置0、1、4、6、8和12h后测定，其峰面积基本一致，RSD为0.8%，表明溶液在12h内稳定。

　　3.5  最低检测限
   
　　按信噪比3∶1计，阿奇霉素的检测限为60ng。

　　3.6  加样回收率试验
   
　　精密称取份已知含量的同一批号的样品，各置50ml容量瓶中，分别加入精密称定的阿奇霉素对照品，用流动相制成相当于含量测定浓度的80%、100%和120%的溶液，3个浓度各测定三次，回收率，低、高、中三种浓度回收率分别为99.2%、100.8%和100.4%；RSD分别为0.66%、0.75%和0.36%，得平均回收率为100.1%。因此选取得高效液相色谱法准确度较好。

　　3.7  样品含量测定
   
　　取阿奇霉素散剂10袋，精密称定装量后，取内容物混合均匀，精密称取适量(约相当于阿奇霉素100mg)置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取续滤液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。另取阿奇霉素对照品同法测定。按外标法计算其含量，并与阿奇霉素散剂原标准［卫生部药品质量标准WS?034(X?022)?97］规定的微生物检定法比较，两种方法的测定结果无显著性差异，结果见表1。

　　图2    方法的专属性图谱    略

　　表1      含量测定　略

　　4  讨论
   
　　(1)阿奇霉素为大环内酯类抗生素，紫外吸收较弱，取其末端吸收210nm波长处测定，可得到满意的响应值。柱温较低时峰形拖尾，在40℃时明显改善。
   
　　(2)对多种不同的流动相［如乙腈∶0.1%三乙胺水溶液(30∶70)(用磷酸调pH值至4.0)［3］；0.5%磷酸二氢铵∶乙腈(73∶27)；甲醇∶水(92∶8)［4］等］进行试验，结果显示，以0.045mol/L磷酸二氢胺溶液∶乙腈(2∶1)(用三乙胺调pH至7.35)为流动相时峰形较好，保留时间合适，主峰与辅料及杂质峰(红霉素峰)能达到基线分离。
   
　　(3)阿奇霉素散剂中的辅料如十六醇、蔗糖等在210nm处有吸收，但均与主峰很好分离，不干扰对阿奇霉素的含量测定。
   
　　(4)虽然采用HPLC法和微生物检定法对阿奇霉素散剂的含量进行测定没有显著性差异，但HPLC法快速、简便，精密度高，误差小，结果准确。

【】
  　　［1］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)［S］. 北京：化学出版社，2005：291

　　［2］ The United States Pharmacopeial Convention Inc. The United States Pharmacopeial ［S］. Rochville MD: The United States Pharmacopeial Comvention Inc., 2002:188

　　［3］ 关倩明，李子雄，张秋莲. HPLC法测定阿奇霉素的含量［J］. 药物分析杂志，1998，18(5)：300

　　［4］ 姜建国，张西茹，杨梁，等. 高效液相色谱法分离测定阿奇霉素及其相关物质［J］. 应用药学，2003(5)：395