加味左金丸对大鼠胃癌前病变增殖细胞核抗原和端粒酶活性的影响
作者：胡运莲 刘桂喜 谭大琦
【摘要】 ［目的］观察加味左金丸对大鼠胃癌前病变增殖细胞核抗原(PCNA，用增殖指数PI表示）和端粒酶活性（用hTERT表示）的影响。［方法］采用甲硝基亚硝基胍（MNNG）、0.03%雷尼替丁、56℃15%盐水、0.85%脱氧胆酸钠、40%乙醇、饥饱失常等多种因素制作大鼠胃癌前病变模型和免疫组化方法检测正常组、恢复组、加味左金丸高、中、低剂量组、维甲酸组大鼠胃黏膜组织中PCNA（换算成增殖指数PI）和hTERT蛋白表达情况。［结果］（1）加味左金丸高、中、低组PI与维甲酸组比较差异有统计学意义（P＜0.05），这四组均与自然恢复组比较差异有统计学意义(P<0.01或0.05)。（2）加味左金丸各组及维甲酸组hTERT蛋白阳性率均较自然恢复组降低，但仅中剂量组有统计学意义(P<0.05)。［结论］加味左金丸通过抑制端粒酶及细胞增殖活性，发挥逆转胃癌前病变的作用。
【关键词】 胃肿瘤 癌前病变 端粒酶 增殖细胞核抗原 加味左金丸
Effect of Adjusted ZuoJin Pills on Proliferating Cell Nuclear Antigen and Telomerase Activity in Rats with Gastric Precancerous Lesion
Abstract:［Purpose］ To observe the effect of adjusted ZuoJin pills(AZP) on proliferating cell nuclear antigen(PCNA, represented by proliferating index,PI) and telomerase activity(represented by human telomerase reverse transcriptase, hTERT) in rats with gastric precancerous lesion(GPL).［Methods］ The model was established by MNNG together with other factors including 15% 56℃ brine, sodium deoxycholate, 40% alcohol stimulus, 0.03% ranitidine，undue hunger, overeating. PCNA(converted to PI) and hTERT was detected by immunohistochemical method, in normal group, sponsaneous recovery group, AZP groups of high?鄄dosage, medium?鄄dosage,low?鄄dosage, and retinoic (RA) group. ［Results］ (1) PI was significantly different between high, medium, and low?鄄dosage AZP groups in each and RA group(P<0.05).Also, PI was significantly different between above 4 groups in each sponsaneous recovery group (P<0.01 or 0.05). (2) The positive expression rate of hTERT protein could be decreased in all the AZP groups and the RA group. There was significant difference only between the medium?鄄dosage AZP group and the sponsaneous recovery group (P<0.05). ［Conclusion］ AZP makes GPL reversed in rates by inhibiting activity of telomerase and cell proliferating.
Key words: gastric neoplasms; precancerous lesions; telomerase; proliferating cell nuclear antigen; adjusted ZuoJin pills
近年研究表明，端粒酶活化是细胞保持持续分裂增殖的基础，与细胞的异常增殖密切相关，是肿瘤发生学上的一个共同途径，在肿瘤的发生中起非常重要的作用[1]。增殖细胞核抗原（PCNA）是目前被公认的能较好地判断细胞增殖状态的一项指标。关于胃癌、胃癌前病变中端粒酶活性和细胞增殖活性以及两者相关性的研究已有较多报道，但中西药物对其活性影响的临床或/和实验研究报道则不多见。加味左金丸是全国第二批名老中医药专家程丽芳教授的经验方，原汤剂临床应用30余年，萎缩性胃炎及其癌前病变疗效肯定[2]。在实验病研究[3]的基础上，笔者又从蛋白水平探讨了其部分作用机制，现就其对大鼠胃癌前病变PCNA和端粒酶活性的影响报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要药品、试剂及仪器
甲硝基亚硝基胍（MNNG）为Fluka公司产品，用双蒸水配成1g/L的母液4℃避光储存，每周配1次，临用时用双蒸水配成所需浓度；脱氧胆酸钠购自湖北省医药公司；维甲酸由上海第六制药厂生产；雷尼替丁由杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产；75%乙醇，用双蒸水稀释成40%的浓度；加味左金丸水煎液由黄连6g、吴朱萸6g、党参10g、茯苓10g、醋柴胡10g、白芍15g、法半夏10g、三七粉3g(冲)、莪术10g、白花蛇舌草15g、百合10g、炙甘草6g组成，由湖北省中中药制剂室供给，浓度为2g/ml。
即用型PCNA单抗、即用型端粒酶催化活性亚单位（hTERT）多抗、SP试剂盒、DAB即用型显色试剂盒均购自北京中山生物技术公司。显微摄像全自动图像分析仪由武汉大学医学院病理教研室提供，软件为同济千屏影像工程公司HPIAS2000型图像分析软件。
1.2 造模及给药方法
选用SPF级6周龄SD雄性大鼠60只，体重100g~120g（武汉市疾病预防控制中心提供）。造模参照严茂祥[4]综合方法并加以改进。大鼠自购进后适应性喂养1周。从60只大鼠中随机抽取10只作为正常组，其余50只用于造模。正常组大鼠不做任何处理；造模大鼠每日自由饮用100μg/ml MNNG液(饮料瓶用油漆涂黑避光)、进食含0.03%雷尼替丁的纯鼠饲料、上午用56℃、15%的氯化钠液按10ml/kg灌胃，进食2d、禁食1d，进食当天下午用0.85%脱氧胆酸钠溶液按10ml/kg灌胃，禁食当天下午用40%乙醇按10ml/kg灌胃，连续24周。24周末时随机抽取正常组和造模大鼠各1只，杀检，观察组织病变化（以HE染色光学显微镜下观察的结果为主），确认模型是否成功。
造模过程中共死亡6只。模型成功后，将造模存活的43只大鼠随机分为恢复组11只，维甲酸组8只，加味左金丸高、中、低剂量组（简称高、中、低剂量组）各8只。高剂量组每日每只按20g/kg（相当于成人一日用量的2倍）灌胃，中剂量组按10g/kg（相当于成人一日用量）灌胃，低剂量组按5g/kg（相当于成人一日用量的一半）灌胃。维甲酸组按40mg/kg灌胃。上述16周。自然恢复组同正常组大鼠常规饮食。40周末所有动物禁食1d，处死，剖腹取胃，沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗，肉眼观察，平铺于硬纸板上，于胃窦部剪取组织1块，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片5μm，免疫组织化学染色。
1.3 检测方法
免疫组织化学用SP法，按试剂说明书操作，DAB显色，PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。免疫组化染色阳性信号为棕色，PCNA阳性物质定位于细胞核，hTERT阳性物质定位于细胞浆。采用显微摄像机图像分析系统，每张切片检测5个视野（×400）。计算PCNA阳性细胞数以及腺上皮细胞总数（每例≥200个），求出细胞增殖指数（PI），PI＝PCNA阳性细胞数／腺上皮细胞总数×100%。hTERT：无阳性细胞或阳性细胞数＜25%为(-)，阳性细胞数25%～50%为(+)，阳性细胞数50%～75%为(++)，阳性细胞数>75%为(+++)。
1.4 统计学方法
PI值的比较采用t检验，hTERT蛋白表达阳性率的比较采用χ2检验。
2 结 果
各组大鼠胃黏膜PI及hTERT蛋白表达阳性率见表1、表2。
正常胃黏膜增生带细胞可见PCNA阳性细胞，但正常组PI与自然恢复组比较差异有显著性(P<0.01)；加味左金丸各组及维甲酸组与自然恢复组比差异有显著性(P<0.01)；加味左金丸各组与维甲酸比较差异有显著性(P<0.05)，与正常组比较差异无显著性(P>0.05)，加味左金丸高、中、低剂量组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
正常大鼠胃黏膜没有hTERT蛋白表达。自然恢复组大鼠5例全呈阳性表达，阳性率100%。加味左金丸各组及维甲酸组hTERT蛋白阳性率均较自然恢复组降低，仅中剂量组与自然恢复组比较差异有显著性(P<0.05)，而加味左金丸高、低剂量组及维甲酸组与自然恢复组比较差异无显著性（P＞0.05）。
3 讨 论
端粒酶[5]是一种逆转录酶，至少由3个亚单位组成，即端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白l和端粒酶催化活性亚单位（hTERT)，但仅hTERT水平与细胞端粒酶活性呈正相关[6]，所以，目前常用检测hTERT来代端粒酶的活性。当端粒酶激活后，端粒不再继续缩短，而维持一种动态平衡状态，使细胞获得无限增殖的能力。由此可见，端粒酶的激活和端粒长度的稳定是细胞永生化及恶变的关键[7]。也正因为基于此种原因，端粒酶有望成为观察抗肿瘤药物的疗效及肿瘤基因治疗的新靶点。
近年来，研究发现由胃黏膜正常细胞→胃癌前病变→胃癌的过程中，端粒酶逐渐被激活[8]，而且其阳性率、活性水平相应地逐渐增高；也有研究发现端粒酶阳性的胃癌或癌前病变细胞增殖活性（PCNA）明显高于阴性者[9]，均说明端粒酶的激活在胃黏膜癌变形成、中扮演重要角色。但中西药物对胃癌、胃癌前病变中端粒酶活性影响或以端粒酶为治疗靶点的临床或/和实验研究报道则不多，仅见胃转安方[5]、榄香烯[9]、叶酸[10]三种药物的相关报道，而且均侧重于干预（阻断）作用的实验研究，结果显示此三种药物均能有效地干预大鼠胃癌前病变或慢性萎缩性胃炎的病理状况和抑制其端粒酶活性及细胞增殖活性。本实验研究侧重于观察加味左金丸对大鼠胃癌前病变的治疗（逆转）作用，结果显示正常大鼠胃黏膜增殖带可见PCNA阳性细胞，但没有hTERT活性表达，自然恢复组大鼠PI明显高于正常组，hTERT蛋白阳性表达率100%，表明在胃癌前病变阶段，由于各种因子的刺激而导致了端粒酶被激活和细胞增殖活性增加，使部分细胞逃脱死亡危象,并出现永生化或恶性增殖。应用加味左金丸治疗16周后，模型大鼠胃黏膜PI和hTERT蛋白的表达显著降低，表明加味左金丸对其端粒酶活性和细胞增殖活性有明显的抑制作用。本研究说明加味左金丸治疗大鼠胃癌前病变获效的机制之一可能与该方抑制端粒酶活性，从而抑制胃黏膜恶性增殖，增加细胞稳定性，恢复细胞增殖与凋亡的平衡有关。
目前，临床上尚无有效阻断或/和逆转胃癌前期病变的药物。复习发现，近年来将维甲酸用于胃癌前病变的动物实验和临床治疗研究的报道相对较多[11，12]，结果也显示其具有部分阻断和逆转作用，因而本实验选用其作为阳性对照药。笔者前期实验病理学研究[3]也证实维甲酸具有逆转肠化生和不典型增生的作用，但没有改善大鼠的一般状况和炎症及萎缩的作用。本实验研究显示维甲酸对胃癌前病变大鼠胃黏膜细胞增殖活性具有明显的抑制作用，但逊于加味左金丸；对hTERT蛋白表达的作用虽有一定程度降低，但无统计学意义。这一方面说明维甲酸逆转胃癌前期病变的机制之一与抑制胃黏膜细胞增殖活性有关，而与抑制端粒酶活性无关，另一方面则显示了加味左金丸的作用优于维甲酸，其原因可能与中药复方成分多、中医整体调理能够进行多基因、多靶点、多途径、多层次调控等优越性有关。提示中医药治疗胃癌前病变具有一定优势，深入开展以端粒酶为靶点的中医药治疗研究必将为防治胃癌前病变开辟新的途径。
【文献】
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