RNA干扰Nucleostemin基因对人食管癌Eca?109细胞株增殖影响的实验研究

          作者：郑学芝，刘桂莲，李丽，孙卫，念红，胡静,蔡子微

【摘要】  目的 筛选NS基因特异性siRNA阳性细胞克隆，研究NS基因特异性RNA干扰对Eca?109细胞株体外增殖能力的影响。方法 用脂质体法将NS特异性siRNA表达载体转染Eca?109细胞，Zeocin抗生素压力筛选后用PCR方法鉴定阳性克隆；MTT法检测各组细胞的生长增殖情况，RT?PCR方法检测NS基因表达量的变化情况。结果 与对照组比较，silencer组肿瘤细胞趋于分化，细胞增殖抑制率超过80%(P<0.01)，差异具有显著性； NS基因表达量下降。结论 NS基因特异性RNA干扰抑制人食管癌Eca?109细胞株体外增殖，使NS基因表达量下降。

【关键词】  Nucleostemin（NS）;RNA干扰；食管癌；基因表达；细胞增殖

　　Abstract：Objective   To screen NS gene specific positive cell clones,and investigate the effect of human esophagus cancer Eca?109 cells proliferation in vitro by NS gene specific RNA interference.Methods  The NS?siRNA expression vector was transfected into human esophagus cancer Eca?109 cells using LIPOFECTAMINETM2000 Reagent, and positive clones were examined by PCR after stable transfectans screening with Zeocin; detected  the cell proliferation by MTT assay  and  the levels of NS gene expression by RT?PCR.Results  Compared with the two control groups, the silencer group cells were nearer differetiation,the proliferation inhibitory rate was higher than 80%(P<0.01)；the level of NS gene expression reduced.Conclusion  The NS gene specific RNAi can significantly inhibit human esophagus cancer Eca?109 cells proliferation in vitro and reduce the level of NS gene expression.

　　Key words：Nucleostemin（NS）;   RNA  interference;   Esophagus cancer； Gene expression;  Cell proliferation

　　0  引言
   
　　NS基因是美国国立卫生研究院的学者Mckay and Tsai  2002年新发现的一种蛋白质核因子［1］，该基因在干细胞及人类的数种肿瘤细胞中表达丰度很高，但在分化的成体组织中，该基因却不表达。二位学者提出干细胞与癌细胞均由相同的蛋白质－NS来决定其细胞自我复制的能力，NS可能是干细胞和肿瘤细胞通过G2/S检验点的特异性调控因子。本文将以人食管癌Eca?109细胞株为实验材料探讨NS基因特异性RNA干扰对食管癌Eca?109细胞株体外增殖能力的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

    人食管癌Eca?109细胞购于上海细胞所； 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶为Gibco公司；PCDNA4/C?NS?silencer质粒 [2]；MTT、DMSO、Zeocin、LipofectamineTM2000Reagent：Invitrogen公司;RNA、DNA试剂盒;RT?PCR试剂盒：TaKaRa公司;引物合成：上海申能博彩生物科技有限公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞培养及NS基因转染 

　　人食管癌Eca?109细胞培养于含10%FBS的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2潮湿空气的CO2培养箱内培养。脂质体法将PCDNA4/C?NS?silencer质粒及空载体PCDNA4/C?vector质粒转染 Eca?109细胞，分别命名为silencer组、vector组，未转染的Eca?109细胞记为normal组。转染细胞进行Zeocin抗生素筛选；阳性细胞克隆继续在含Zeocin抗生素的培养基中进行扩大培养。

　　1.2.2  阳性细胞克隆的鉴定 

　　提取克隆细胞基因组DNA，以Zeocin基因为目的基因，通过PCR方法进行细胞克隆外源基因整合阳性鉴定，同时以normal组肿瘤细胞作对照。其引物序列为：上游引物5′?atggccaagttgaccagtgc；下游引物为5′?tcagtcctgctcctcggcca。 PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后 94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循环，最后72℃延伸10min；PCR产物大小约370bp。

　　1.2.3  生长曲线的绘制 [3] 

　　将三组细胞传到24孔板上（1×104细胞/孔），每组18复孔，分别于24h、48h、72h、96h、120h、144h用计数板进行活细胞计数，绘出各组细胞的生长曲线。

　　1.2.4  细胞的形态学观察 

　　倒置显微镜下观察各组细胞形态变化情况。

　　1.2.5  MTT比色法测定细胞增殖抑制率 [3] 

　　在96孔培养板上接种三组细胞，每组24复孔（1×103细胞/孔），分别于24h、48h、72h三个时间段进行MTT测定，以培养液做空白对照并调零，用酶标仪测定490nm处的吸光度值（OD值），每次每组测定8复孔。

    细胞增殖抑制率＝1-细胞存活率

    即细胞增殖抑制率＝（1-silencer组OD值  / Normal组OD值）×100%

　　1.2.6  各组肿瘤细胞NS基因表达水平检测 

　　提取肿瘤细胞总RNA，用RT?PCR方法验证各组肿瘤细胞NS基因表达情况。参照genebank中NS和GAPDH的基因序列及 [4]设计引物如下:NS基因上游P1：5′?atgaaaaggcctaagttaaagaaagc，下游P2：5′?gctctccaaattctcctttggta；GAPDH上游为P3：5′?ggtggacctgacctgccgtctaga，下游P4：5′?ttactccttggaggccatgtggg；扩增产物长度分别为570bp和280bp，在同一体系内反应，PCR反应条件为94℃预变性5min， 94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循环，最后72℃延伸10min。

　　1.2.7  统计学分析 

　　实验数据以±s表示，统计学处理采用SPSS 11.5 软件，进行t检验。

　　2  结果

　　2.1  PCR法鉴定阳性细胞克隆

    抗Zeocin的细胞克隆部分PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图1；silencer组与vector组皆检测到Zeocin基因条带，而normal组无，即细胞克隆外源基因整合阳性。

　　2.2  细胞生长曲线的绘制

    各时间段silencer组细胞数目低于对照vector组（P<0.01）和normal组（P<0.01），差异具有显著性；细胞生长曲线见图2。

　　2.3  各组细胞的形态学变化

    silencer组细胞与对照vector组和normal组相比体积变小并趋向于均一，多数细胞由梭形趋向变圆，核质比变小，瘤巨细胞减少，细胞趋于分化。

　　2.4  MTT比色法测定细胞增殖能力

    细胞培养24h后，silencer组细胞增殖抑制率分别为normal组（P<0.01）的94%和vector组（P<0.01）的93%；细胞培养48h后，silencer组细胞增殖抑制率分别为normal组（P<0.01）的80%和vector组（P<0.01）的78%；细胞培养72h后，silencer组细胞增殖抑制率分别为normal组（P<0.01）的88%和vector组（P<0.01）的87%；细胞增殖曲线见图3。

　　2.5  各组肿瘤细胞NS基因表达水平

    silencer组肿瘤细胞NS基因表达水平明显低于对照vector组和normal组，见图4。

　　3  讨论

    NS基因是一种p53结合蛋白，主要存在于核仁中，在核质中也有低量表达；在干细胞处于早期多潜能状态时该基因的表达丰度很高，而在分化开始时，这个基因的表达却突然几乎完全消失 [1]。本室与中科院遗传发育研究所合作证实了多种肿瘤组织中都有NS基因的表达 [5，6]，运用siRNA真核表达载体，使宫颈癌Hella细胞的增殖被抑制，细胞内NS基因的表达量下降 [7，8]。

    本实验将PCDNA4/C?NS?silence载体转染人食管癌Eca?109细胞，同步转染PCDNA4/C?vector空载体作对照。经过Zeocin抗生素压力筛选获得阳性细胞克隆，并通过PCR方法验证克隆细胞外源基因整合阳性。与对照组vector和normal组比较，silencer组细胞的肿瘤生物学行为发生了显著的变化，细胞增殖明显变慢，趋向于分化； MTT法进行细胞增殖抑制率测定显示silencer组细胞的增殖速率明显低于两对照组；细胞增殖抑制率大于80%；各组细胞RT?PCR产物电泳结果显示silencer组肿瘤细胞中NS基因表达量明显下降。

    实验结果表明，我们构建的针对NS基因的特异性siRNA的表达载体PCDNA4/C?NS?silencer是成功并有效用的，将其转染入人食管癌细胞后，通过RNA干扰机制使部分NS基因沉默，从而产生了抑制Eca?109细胞分裂、增殖的效应。同时提示调节NS基因活性可能对肿瘤有防治作用， NS基因能够预测肿瘤的趋势，有可能成为一种新的肿瘤标记物。但是NS蛋白活动的精确分子机制尚不完全清楚，这仍然需要大量的实验工作去证实。运用RNA干扰技术对NS基因进行深入研究可能会揭示或部分揭示干细胞和肿瘤细胞增殖之迷，为肿瘤的早期诊断、基因和预后及以干细胞为基础的组织工程等提供理论依据和工作基础。

【】
  　　［1］Tsai RY，Mckay RD.A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells [J].Genes & Dev,2002,16(23):2991?3003.

　　
　　 [2] 蔡子微，刘思金，劳为德，等 . NS特异性siRNA真核表达载体的构建 [J]. 牡丹江医学院学报，2003，24（3）:1?4.

　　 [3] 薛庆善. 体外培养的原理与技术 [M]. 北京：技术出版社，2001.340?343.

　　 [4] 刘思金，薛延，劳为德，等.人类骨桥蛋白（hOPN）在细胞增殖中的功能研究 [J]. 高技术通讯，2003，3（2）：25?28.

　　 [5] 刘思金，蔡子微，胡国法，等. NS基因克隆及人成骨肉瘤细胞和人胚胎肾细胞NS基因的表达 [J].牡丹江医学院学报，2003， 24（2）：5?7.

　　 [6] Liu SJ,Cai ZW,Lao WD,et al.Role of nucleostemin in growth regulation of gastric cancer,liver cancer and other malignancies [J].World Journal of gastroenterology,2004,10(9):1246?1249.

　　 [7] Liu SJ,Cai ZW,Liu Yj,et al.The effect of knocking?down Nucleostemin gene expression on the in vitro proliferation and in vivo tumorigenesis of Hella cells [J]. Experimental & Clinical Cancer Research,2004,23(3):207?216.

　　 [8] 蔡子微，刘思金，孙丽秋，等.Nucleostemin特异性RNA干扰对Hela细胞体内外增殖能力的影响 [J].病理生杂志，2005，21（7）:1331?1335.