右旋柠烯对HL-60、K562白血病细胞体外作用的研究

        作者：郭晓铭，路晴，刘正娟，王莉芬，冯秉安

【摘要】  　　本研究观察右旋柠烯(d-limonene，D-L)对HL-60和K562白血病细胞增殖凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制。首先采用碘化丙锭染色法观察右旋柠烯对HL-60、K562细胞增殖的影响，再通过细胞形态学观察、流式细胞术分析、免疫细胞化学半定量测定突变型p53、bcl-2、bax基因的表达水平，系统观察D-L对HL-60、K562细胞体外诱导凋亡的情况。结果表明： D-L抑制HL-60和K562细胞的增殖，IC50均为0.75 mmol/L，呈剂量时间依赖关系； D-L诱导HL-60、K562细胞凋亡；D-L在诱导HL-60细胞凋亡过程中随作用浓度增加，bcl-2的表达下降；D-L在诱导K562细胞凋亡过程中随作用浓度增加，突变型p53及bcl-2的表达下调，而bax的表达上调。结论： D-L抑制HL-60和K562细胞增值并诱导其凋亡；突变型p53，bcl-2，bax参与了D-L诱导凋亡的基因调控。

【关键词】  右旋柠烯； HL-60； K562细胞； 细胞增值； 细胞凋亡

　　Effects of D-limonene on Leukemia Cells HL-60 and K562 in Vitro

　　Abstract To investigate the effects of D-limonene(D-L) on the cell growth and apoptosis in HL-60，K562 cells and to elucidate its mechanism，the influence of D-L on proliferation of HL-60 and K562 cells was determined by propidium iodide assay，the expression levels of mutant p53，bcl-2，bax gene were detected by cell morphological analysis，flow cytometry and immunohistochemistry staining，the D-L-inducing HL-60 and K562 cell apoptosis in vitro was observed systematically.    The results showed that D-L inhibited HL-60 and K562 cell growth in a dose-and time-dependent manner with the IC50 of 0.75 mmol/L similarly，D-L induced apoptosis of HL-60 and K562 cells，and    expression of  bcl-2 gene was down regulated by D-L in a concentration-dependent manner in HL-60 cells.The bcl-2，mutant type of p53 genes were down regulated while bax gene was up regulated by D-L in a concentration-dependent manner in K562 cells.  It is concluded that D-L can  inhibit proliferation and induce apoptosis of HL-60 and K562 cells. The bcl-2，mutant type of p53 and bax may be involved in the gene regulation of D-L-induced apoptosis.

　　Key words D-limonene; HL-60，K562; Cell proferation; Apoptosis

　　右旋柠烯（D－limonene，D-L）是一种天然单萜烯类化合物，在桔皮精油中的含量>90%，学名1-甲基-4-异丙基环己烯，分子式C10H16，分子量136.23。D-L是limonene中最普遍存在的一种异构体，具有新鲜柠檬香气和抗氧化、抗炎、利胆溶石等作用。近年发现D-L具有抗癌活性，用于预防及化学致癌物诱导的结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌等取得了相当的效果［1-3］。目前对其抗癌作用的研究主要集中其对实体瘤的作用机制上，关于其对非实体瘤的作用的研究报道尚少。本实验选用HL-60、K562白血病细胞，体外观察D-L对这些细胞增殖抑制及诱导凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制，以期寻找新的安全有效的预防和治疗白血病的制剂。

　　材料和方法

　　材料

　　右旋柠烯购自美国Sigma公司，含量97%，用二甲亚砜(DMSO)稀释至所需浓度。DMEM培养液(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，pH 7.2)，碘化丙锭(propidium iodide，PI )，毛地黄皂苷（digitonin)，DMSO均购自于Sigma公司。突变型p53，bcl-2及bax鼠抗人即用型IgG单克隆抗体购自福州迈新生物公司。细胞凋亡Hoechst染色试剂盒购自于碧云天生物技术研究所。

　　方法

　　细胞培养 

　　人白血病细胞株HL-60(人早幼粒细胞白血病细胞株)，K562(人慢性粒细胞白血病细胞株)由大连中心中心实验室惠赠，常规培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，pH 7.2的DMEM培养液中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度孵箱中培养。加药均在细胞的对数生长期进行。

　　细胞生长曲线的碘化丙锭(PI)染色法测定［4］

　　碘化丙锭染色法的原理：PI为核酸嵌入型染料，可嵌入双股螺旋多核苷酸的结构，但是不能穿过活细胞的胞膜，故活细胞拒染，PI染色后的细胞呈红色荧光，其光密度可在波长530 nm酶标仪下检测。Digitonin可以破坏细胞的胞膜，这样经过digitonin处理后，就可以检测到总的细胞光密度。将对数生长期的白血病细胞以每孔1×105/L的细胞密度加入24孔板中，每孔体积1 ml，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养24小时后，实验孔按1％ DMSO终浓度分别稀释加入0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol/L 的D－L，每种浓度设3个复孔，以1％ DMSO作为阴性对照组。培养目标24、48、72小时后，加入浓度为1 mg/ml的PI，每孔20 μl，作用1小时后，在波长530 nm酶标仪检测凋亡细胞光密度，RPI （实验组的凋亡细胞光密度）和 BPI（阴性对照组的凋亡细胞光密度），测完后每孔加入浓度为38 mg/ml的digitonin   20 μl，作用30-45分钟后，再次用酶标仪分别检测数值RD（实验组总的细胞光密度）及数值BD（阴性对照组总的细胞光密度），按公式：细胞存活率＝（RD-RPI）／（BD-BPI）×100％，计算出细胞存活率，按1-细胞存活率公式计算出生长抑制率，实验重复3次。根据细胞存活率以及药物浓度描绘出细胞生长曲线图。用细胞存活率对剂量对数作图法求出IC50(半数抑制浓度)。

　　细胞凋亡率的流式细胞术检测 

　　收集经不同药物浓度处理后的及阴性对照组的白血病细胞（细胞密度为1×106/L）。于实验的第2天取细胞，用PBS洗涤2次后，于旋涡混匀状态； 滴入95%的乙醇，使乙醇的浓度为70%-75%，固定细胞24小时以上；离心去除乙醇，用PBS洗涤2次，37℃水浴30分钟，加入PI混合液(PI的终浓度为50 μg/ml)；室温孵育20分钟，经350目尼龙网过滤后，在流式细胞仪测定细胞凋亡率。

　　细胞凋亡的荧光染色检测 

　　离心收集不同药物浓度处理的细胞样品于1.5 ml离心管内，加入0.5 ml固定液，缓缓悬浮细胞，固定10分钟或更长时间 (可4℃过夜)。固定后离心去固定液，用PBS洗2遍，每次3分钟。洗涤期间用手动晃动离心管数次。最后1次离心后洗去大部分液体，保留约50 μl液体，再缓缓悬浮细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。均匀滴上0.5 ml Hochest 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。滴1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上1洁净的盖玻片，尽量避免气泡。荧光显微镜检测细胞的凋亡情况，凋亡细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

　　免疫组织化学染色法检测 

　　收集经不同浓度药物处理48小时的各组细胞，分别涂片，冷丙酮中固定，用bcl-2，bax，突变型p53抗体SABC免疫组织化学染色试剂盒检测K562细胞bcl-2，bax，突变型P53蛋白表达。

　　统计学处理

　　所有实验均至少重复3次，并得到一致结果。结果用SPSS 10.0软件分析，以平均值±标准差(X±SD)表示。组内比较进行单因素方差分析，等级资料采用秩和检验。P<0.05被认为有统计学意义。

　　结果

　　D-L对白血病细胞株增殖的影响

　　用PI染色法分析D-L对HL-60、K562白血病细胞的增殖抑制作用，IC50均为0.75 mmol/L。D-L对HL-60、K562细胞的生长抑制作用随着作用浓度的增加而明显增加，呈剂量依赖性(图1)，0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 mmol/L的抑制率之间比较，经方差分析具有显著性差异（FK562=2664.193，FHL-60=2195.665，P<0.01）；D-L对HL-60、K562细胞的生长抑制作用随着作用时间的延长而明显增加，呈时间依赖性(图2，3)。24、48、72小时的抑制率之间比较，经方差分析后具有显著性差异（FK562=201.578，FHL-60=252.163，P<0.01）。D-L对HL-60、K562细胞的生长抑制作用，经3×2×2析因分析，结果提示统计学上无显著性差异（F=0.912，P>0.05）。

　　D-L诱导白血病细胞凋亡的形态变化

　　HL-60、K562细胞经D-L 0.75 mmol/L的作用48小时后，光学显微镜下可见典型的凋亡形态学改变，表现为细胞体积缩小，细胞膜完整，胞浆中出现空泡等改变。Hochest 33258染色后于荧光显微镜下观察，活细胞核呈弥散均匀荧光，而凋亡细胞染色质呈致密浓染的块状或颗粒状荧光（图4）。

　　D-L对白血病细胞的bcl-2、bax、突变型p53基因表达的影响

　　经D-L处理后的HL-60细胞株与对照组比较，bcl-2基因表达明显降低，且与D-L的浓度呈依赖关系；而bax及p53基因表达在处理组与对照组之间没有统计学差异（H=4.67，P>0.05）。经D-L处理后的K562细胞株与对照组比较，细胞内的突变型p53及bcl-2基因表达明显降低，bax基因表达增加，经秩和检验统计处理后显示，经不同浓度的D-L处理的K562细胞中的突变型p53、bcl-2基因的表达均有下降，而且0、0.5、0.75 mmol/L不同的处理组之间有显著的统计学差异（H=13.6，P<0.01）（图5）。

　　D-L作用48小时后的HL-60和K562细胞凋亡率

　　D-L 0.5、0.75、1.0 mmol/L分别作用于HL-60、K562细胞48小时后，流式细胞仪测得典型的亚二倍体凋亡峰，HL-60细胞的凋亡峰分别为7.31±1.17%，30.07±2.17%，25.06±1.78%；K562细胞的凋亡峰分别为5.43±1.01%，38.23±2.12%，30.07±1.96%（图6，7）。通过方差分析，D-L对白血病细胞的诱导凋亡作用随着剂量的增加而增强，0、0.5、0.75、1.0 mmol/L时的凋亡峰之间的比较有显著的差异性（F=753.628，P<0.01）。在1.0 mmol/L的D-L处理后的凋亡峰有下降趋势。而D-L对K562、HL-60细胞的诱导凋亡作用之间比较没有显著性差异（F=1.265，P>0.05）。

　　讨论

　　右旋柠烯作为一种极具开发潜力的预防和癌症的制剂，日益受到国内外学者的广泛的关注。目前对其抗癌作用的研究主要集中在实体瘤方面，而其对非实体瘤包括白血病的作用研究报道尚少。本研究表明，D-L可以抑制HL-60、K562白血病细胞增殖并诱导凋亡。IC50均为0.75 mmol/L。D-L抑制HL-60、K562细胞增殖的作用呈现剂量-时间依赖效应。HL-60、K562细胞经D-L 0.75 mmol/L作用48小时后出现典型的凋亡形态学改变，Hochest 33258染色后凋亡细胞染色质呈致密浓染的块状或颗粒状荧光；D-L作用48小时后用流式细胞仪可以检测到凋亡峰，并且呈剂量依赖性，但是当剂量大于IC50时，凋亡峰有下降，提示其诱导凋亡的作用有下降趋势。这种结果从另一个方面提示当D-L达到一定程度后可能具有细胞毒作用，从而导致诱导凋亡机制的减弱，其中的具体机制有待于进一步的探索。D-L诱导白血病细胞凋亡的作用在HL-60、K562细胞之间没有区别。D-L对白血病细胞增殖的抑制作用可能是通过诱导其凋亡而实现的。

    细胞凋亡是在基因控制下的细胞自我消亡过程。目前已有的研究表明，细胞增殖和癌变有关的原癌基因和抑癌基因，如bcl-2、p53等［5］都参与了对细胞凋亡的调控。bcl-2是第一个被确认抑制凋亡作用的基因，是一种膜整合蛋白，于细胞中的线粒体核膜和内质网上，在细胞内的高表达可以引起肿瘤发生。突变型p53在细胞内的高表达也可以引起肿瘤的发生，bax基因是bcl-2基因家族的成员，其功能与bcl-2基因相反，为促凋亡基因。突变型p53抑制野生型p53诱导细胞凋亡的作用，还可以拮抗c-myc基因引起的凋亡，增强细胞的增殖活性，促发细胞癌变。实验中发现，经D-L处理后的HL-60细胞株与对照组比较，bcl-2基因蛋白表达明显下调，bax及突变型p53基因蛋白表达没有区别；而经D-L处理后的K562细胞株与对照组比较，bcl-2及突变型p53基因蛋白表达是下调的，bax基因蛋白表达是上调的。因此，可以认为D-L具有诱导白血病细胞凋亡的作用，但对于不同的细胞株其诱导凋亡的机制是不同的。

【】
  　　1 Sylvestre M，Legault J，Dufour D，et al. Chemical composition and anticancer activity of leaf essential oil of Myrica gale L. Phytomedicine，2005; 12:299-304

　　2 Lu XG，Zhan LB，Feng BA，et al. Inhibition of growth and metastasis of human gastric cancer implanted in nude mice by d-limonene. World J Gastroenterol，2004; 10:2140-2144

　3 Parija T，Das BR. Involvement of YY1 and its correlation with c-myc in NDEA induced hepatocarcinogenesis，its prevention by d-limonene. Mol Biol Rep，2003; 30:41-46

　　4 Zhang L，Mizumoto K，Sato N，et al. Quantitative determination of apoptotic death in cultured human pancreastic cancer cells by propi-dium iodide and digitonin. Cancer Lett，1999; 142:129-137
　　
　　5 王兴旺，胥彬. 细胞凋亡在肿瘤基因治疗中的意义. 肿瘤，1997; 17:292-294.