夏枯草高效液相色谱指纹图谱的研究

       作者：杨辉 李军 郭伟英 赵咏

【摘要】  　　目的： 建立夏枯草的指纹图谱分析方法，并对不同产地的夏枯草进行指纹图谱的比较研究。方法：以齐墩果酸为参照，采用高效液相色谱法，色谱柱为Hypersil C18，流动相为甲醇：水：醋酸（86：14：0.1），检测波长为208nm，流速为1ml/min。结果： 标出10个主要共有峰，方法学考察表明，本研究建立的分析方法有较好的重现性，比较了不同产地夏枯草药材与标准药材指纹图谱的相似性。结论： 方法稳定、可靠、简便，为提高夏枯草药材质量控制提供依据。

【关键词】  夏枯草； 高效液相色谱； 指纹图谱

　　夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，我国各地均产，主产于江苏、浙江、安徽、河南等地［1］。夏枯草临床应用广泛，药典中载有“清火、明目、散结、消肿”［2］之功效，研究表明夏枯草还具有降血脂，降血糖，免疫抑制以及抗肿瘤等作用［3］。目前，市场上夏枯草产地多，质量不一，缺乏统一质量检测标准，通常采用测定其中一、两种化合物含量的方法来进行质量评价，不足以全面反映药材的整体质量。本研究利用高效液相色谱法对夏枯草进行了指纹图谱的研究，结果表明，本方法稳定、可靠、重现性好，可为夏枯草药材质量控制提供有效的依据。

　　1  仪器与试药
   
　　日立高效液相色谱仪，DAD检测器，EZChrom Elite色谱工作站；KQ?100A型超声波清洗器；天平。
   
　　夏枯草对照药材及齐墩果酸对照品由药品生物制品检定所提供。夏枯草药材分别购自各地药材市场和药店，经鉴定为夏枯草药材的干燥果穗。
   
　　甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件
   
　　色谱柱：Hypersil C18，4.6*250mm，10μm；流动相：甲醇：水：醋酸（86：14：0.1）；检测波长为208nm；流速为1ml/min。

　　2.2  供试品溶液的制备
   
　　将夏枯草药材择去杂质，60℃恒温干燥，粉碎机粉碎，粉末过40目筛，反复进行，直至药材粉碎全部过筛为止。精密称定夏枯草药材粉末约1g，加入90%甲醇20ml，超声30min，过滤，洗涤，合并滤液和洗液，挥干溶剂，残渣加流动相溶解定容至10.00ml，溶液用微孔滤膜过滤，得夏枯草液，10μl进样。

　　2.3  流动相的选择
   
　　试验过程中，系统比较了不同配比的甲醇?水（80：20；84：16；86：14；88：12）和乙腈?水（80：20；85：15；90：10）及添加剂的用量。结果表明，以甲醇：水：醋酸（86：14：0.1）为流动相系统效果较佳。

　　2.4  检测波长的选择
   
　　试验采用DAD检测器，在波长190～400nm范围内进行夏枯草样品的吸收情况考察。通过比较各不同保留时间的峰的紫外吸收光谱，得知多数峰的最大吸收在203～210nm范围，少数在230nm附近，综合比较各波长处的色谱图，最终确定208nm作为检测波长。

　　2.5  参比峰的选择
   
　　为消除测定结果的系统误差，选取与其它组份分离较好、峰形对称、保留时间24.617min的色谱峰作为参比峰（经与标准品色谱图谱及紫外吸收图谱对照，得知此组份为齐墩果酸），以便夏枯草药材共同特征组份的相对保留时间和相对含量［4］。
   
　　夏枯草标准药材的色谱图及齐墩果酸标准品色谱图见图1和图2。

　　2.6  方法学验证

　　2.6.1  精密度试验  同一夏枯草样品液，在相同条件下，重复进样5次，得到色谱图，计算保留时间和峰面积的RSD%。结果见表1。

　　2.6.2  重现性试验  同一夏枯草样品在相同条件下平行提取5份，分别进样，得到色谱图，保留时间和峰面积的RSD%。结果见表2。

　　2.6.3  稳定性试验  同一夏枯草样品液分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h进样，计算所得色谱图中各相对应的保留时间和峰面积的RSD%。结果见表3。

　　图1  夏枯草标准药材色谱图（略）                   

　　图2  齐墩果酸标准品色谱图（略）

　　表1  精密度试验（略）

　　表2  重现性试验（略）

　　表3  稳定性试验（略）

　　2.7  夏枯草HPLC指纹图谱的建立
   
　　按供试品的制备和检测方法，对31份夏枯草药材分别测定色谱图。比较各夏枯草药材的色谱图，结合各组份峰的紫外吸收特征，确定相同组份峰，计算各组份相对保留时间及相对峰面积。
   
　　αi=ti / ts ，α为相对保留时间，ts为内参峰保留时间，ti为其它组分保留时间。
   
　　Ar=Ai×100/∑A ，Ar为相对面积值，Ai为各组分面积值，ΣA为总峰面积。
   
　　选取10个主要共有峰为特征峰，其面积和占到总面积的99%以上，建立夏枯草样品药材的HPLC相对保留值指纹图谱。结果见表4，其中αi为31种样品谱图中相同组份的相对保留时间值的平均值。

　　2.8  夏枯草HPLC指纹图谱相似度的计算
   
　　以10批夏枯草对照药材的HPLC图谱为标准，用计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件计算31个夏枯草样品药材的HPLC图谱与对照药材的相似度。结果见表5。

　　表4  夏枯草样品药材的HPLC相对保留值指纹图谱（略）

　　表5  样品相似度计算结果（略）

　　3  讨论
   
　　对夏枯草的高效液相色谱条件进行了考察，包括流动相的组成、配比等，并依据不同保留时间峰的紫外吸收特征确定检测波长。确定色谱条件为：流动相为甲醇?水?醋酸（86：14：0.1）；流速为1ml/min；进样量为10μl；检测波长为208nm。在此色谱条件下，基线稳定，各峰得到了较好的分离，峰形、保留时间等也较好。
   
　　对中药夏枯草的HPLC指纹图谱进行了系统的研究，建立了31种夏枯草样品药材的HPLC?相对保留值指纹图谱，并进行了夏枯草样品药材与标准药材相似度的研究。为夏枯草药材的质量控制提供了依据，为建立规范化的夏枯草种植基地提供了有效的质量控制手段。

【】
  　　1 郑汉臣，蔡少青．药用植物学与生药学.北京：人民卫生出版社，2004，389．

　　2 国家药典委员会，中华人民共和国药典（一部）.北京：化学出版社，2005，197～198．

　　3 孙维广，廖慧丽，叶志明，等．夏枯草化学及药理研究概况.中医药信息杂志，2003，10（8）：86～88．

　　4 邹纯才，方洪壮，刘娟，等．数字化色谱指纹谱及其在中药研究中的应用.黑龙江医药，2005，28（5）：54～56．