HPLC法测定龟芪壮骨颗粒中二苯乙烯苷的含量

   作者：高永堂1，衣学龙1，王兆华2

【摘要】  目的  应用高效液相色谱法测定龟芪壮骨颗粒中二苯乙烯苷的含量。方法  采用DiamonsilTM(钻石)C18(5μm，250mm×4.6mm)，乙腈－0.2%磷酸溶液（23：77）为流动相，流速：1ml/min，检测波长为320nm。结果  线性范围为0.0964～0.482μg，r=0.9998，平均回收率为98.00％，RDS=0.98％。结论  该方法用于测定龟芪壮骨颗粒中二苯乙烯苷含量，简便、快速、准确。
   
    【关键词】  龟芪壮骨颗粒；二苯乙烯苷；高效液相色谱法
    
       
    【Abstract】  Objective  To develop a HPLC method  to determine the content of 2，3，5，4’-tetrahydroxystibene-2-o-β-D-glucoside in Guiqizhuanggu granule.Methods  The HPLC method was carried out on an DiamonsilTMC18 column(5μm，250mm×4.6mm)using a mobile phase of acetonitrile-0.2% phosphoric acid water(23：77)，and detection wavelength was 320 nm.Results  With a relation efficient of 0.9998. Good linear relationshipe between area and a mount was noted for 0.0964～0.482μg. The average recovery of 2，3，5，4’-tetrahydroxystibene-2-o-β-D-glucoside and RSD were 98.00% and 0.98% respectively. Conclusion  It was proved that the method was available，simple and accurate.
   
    【Key words】  guiqizhuanggu granule； 2，3，5，4’-tetrahydroxystibene-2-o-β-D-glucoside； HPLC
   
    龟芪壮骨颗粒是熟地黄、龟甲、杜仲等十八味中药组成。主要功能为补气补血，滋补肝肾，强筋壮骨。适用于腰膝酸软，气血不足等症。方中主要药物何首乌为蓼科植物何首乌的干燥块根。其有效成分之一为二苯乙烯苷。本实验采用高效液相色谱法［1，2］，测定龟芪壮骨颗粒中二苯乙烯苷的含量作为该制剂的质量控制指标，以便更好地控制该产品质量。
    
    1  仪器与试药
  
    日本岛津LC-10 AT高效液相色谱仪；SPD-10A紫外检测器；KQ—250型超声波处理器；2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-β-D-葡萄糖苷对照品（购于药品生物制品检定所，批号：0844－200003，HPLC面积归一化法，测定含量为99.61％）；龟芪壮骨颗粒由敦化市瑞隆药业有限责任公司提供；其它化学试剂均为国产，AR级。
   
    2  方法与结果
   
    2.1  色谱条件  色谱柱：DiamonsilTM(钻石)C18(5μm，250mm×4.6mm)，乙腈－0.2%磷酸溶液（23：77）为流动相，流速：1ml/min，检测波长为320nm，理论塔板数按二苯乙烯占扑悖?坏陀?000；柱温为室温。
   
    2.2  对照品溶液的制备  精密称取对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.0241mg，作为对照品溶液。
   
    2.3  方法  内容物2g，精密称定，置锥形瓶，加氯仿40ml，超声处理（功率250W，频率20kHz）15min，滤过，药渣挥干氯仿，连同滤纸移入具塞锥形瓶中，精密加入40%乙醇25ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率20kHz）10min，放冷，用40%乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。
   
    2.4  阴性对照溶液的制备  按处方量制备不含何首乌药材的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl，注入液相色谱仪中，按上述条件测定，结果表明，阴性对照溶液色谱图中与对照品位置处无干扰，此法可行，见图1。
    
    2.5  线性关系考察  精密吸取二苯乙烯苷对照品溶液4、 8、 12、16、20μl，分别注入高效液相色谱仪中对照品HPLC色谱图供试品HPLC色谱图阴性对照HPLC色谱图图1  对照品HPLC色谱图、供试品HPLC色谱图、
   
    阴性对照HPLC色谱图
   
    进行分析，以对照品进样量（μg）为横坐标，以对照品的峰面积为纵坐标作图，得一条通过原点的直线，回归方程为：Y=1930369.2X＋3605.115，r=0.9998，结果表明淫羊藿苷在0.0964～0.482μg间呈良好的线性关系。
   
    2.6  精密度试验  精密吸取供试品溶液连续5次重复进样，测得相对偏差RSD=0.86％，测定结果见表1。

表1  精密度实验结果

    2.7  稳定性试验  精密吸取供试品的溶液在 0、2、4、6h，分别进样，进行测定。结果二苯乙烯苷峰面积的RSD=0.245％，表明在6h内供试品溶液的淫羊藿苷含量稳定，测定结果见表2。

表2  供试品溶液稳定性试验结果放置时间（h）

    2.8  重现性试验  精密称取同一批号样品 5份，按供试品溶液的制备方法制备，依法进样分析，样品中二苯乙烯苷含量的RSD=1.49％，测定结果见表3。

表3  龟芪壮骨颗粒重现性试验结果表

    2.9  加样回收率试验  精密称取2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-o-β-D-葡萄糖苷对照品适量，加入到已测知2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-o-β-D-葡萄糖苷含量的龟芪壮骨颗粒样品中，置具塞锥形瓶中，精密加入40％乙醇100ml，按供试品溶液的制备方法制备，进样5μl，以外标法含量，计算回收率，结果见表4。

表4  加样回收率试验测定结果

    2.10  样品的含量测定  按上述方法，制备供试品溶液，测定三批龟芪壮骨颗粒（5g/袋）中二苯乙烯苷的含量，结果见表5。

表5  龟芪壮骨颗粒中二苯乙烯苷含量测定结果

    3  讨论
   
    在对方中二苯乙烯苷测定色谱条件中流动相选择时曾采用乙腈－水（25：75）、乙腈－水（20：80）、乙腈－0.2%的磷酸水溶液（22：78）、乙腈－0.2%的磷酸水溶液（24：76）进行比较实验，结果采用乙腈—0.2%磷酸水（23：77）作为流动相，二苯乙烯苷与其他杂质峰能达到较好分离。
   
    在供试品制备方法选择中，我们采用了冷浸12h、加热回流20min、超声处理10min三种方法进行比较试验，结果表明，超声处理和加热回流提取供试品测定其二苯乙烯苷含量相近，但加热回流提取方法供试品溶液中含有较多的杂质峰，故选用超声处理方法制备供试品。
   
    本含量测定方法适用于测定龟芪壮骨颗粒中二苯乙烯苷的含量，具有方法简便、快速、准确等特点。

【】

    1  冯伟红，李曼玲.HPLC法测定补肾腰痛颗粒中二苯乙烯苷的含量.实验方剂学杂志，2004，10（2）：4.    
    2  国家药典委员会编.中华人民共和国药典.一部.北京：化学出版社