黄磷吸入肺损伤及呼吸窘迫综合征与组织细胞凋亡

                      作者：韦卫琴 梁显泉 虞晓红 吉蒙 

【摘要】  目的： （1）了解大鼠急性黄磷及其化合物吸入中毒致急性肺损伤（ALI）及急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的肺组织病理变化及肺组织细胞凋亡；（2）了解血必净对肺组织病理及细胞凋亡的影响。方法: 健康SD大鼠85只，随机分为正常对照组、模型组以及3个治疗组。建立大鼠急性黄磷及其化合物吸入中毒致ALI-ARDS模型，造模后依时给药和杀鼠，取肺组织行病理检查及细胞凋亡原位检测（TUNEL法）。结果: （1）模型组大鼠肺组织结构严重破坏，出现明显肺水肿、出血、变性、坏死，且有大量炎性细胞浸润，肺组织细胞凋亡数显著增加；（2）3个治疗组肺组织病理损害较模型组均有不同程度减轻，肺组织细胞凋亡数减少。结论： （1）大鼠急性黄磷吸入成功复制了ALI-ARDS模型；（2）血必净对大鼠急性黄磷及其化合物吸入损伤致ALI-ARDS具有治疗作用；（3）肺组织细胞凋亡参与了大鼠急性黄磷及其化合物吸入损伤致ALI-ARDS的病理过程，血必净可能具有调节细胞凋亡作用。

【关键词】  肺； 组织细胞； 中毒； 大鼠，Sprague-Dawley; 黄磷； 细胞凋亡； 血必净

    ［Abstract］ Objective: （1）To study the pathological changes and apoptosis of lung tissues in acute lung injury and acute respiratory distress syndrome (ALI-ARDS) rats induced by acute inhaling of yellow phosphorus (YP) and its compounds；（2） To study the curative effect of Xuebijing. Methods: Eighty-five healthy SD rats were randomly divided into 5 groups: a normal control group (group NC), a ALI-ARDS model group (group MD), and 3 treatment groups (groups A, B, and C). Experimental ALI-ARDS was caused in all the rats except those in group NC by giving YP and its compounds through respiratory tract. Curative results of different treatment medicines by i.v. on the ALI-ARDS were observed in rats of groups MD (5% glucose, 5 ml/kg), A (Xuebijing injection, 5 ml/kg), B (dexamethasone injection, 5 mg/kg ) and C (Xuebijing injection 5 ml/kg plus dexamethasone injection 1 mg/kg) by checking pathological changes and cell apoptosis in rat lung tissues (TUNEL method). Results: （1） In rats of group MD, the lung tissue was injured seriously, and edema, hemorrhage, degeneration, necrosis, and inflammatory cell infiltration obviously occurred in lungs, and the number of apoptosis cells increased remarkably; （2）The pathological damage of lung tissue of rats in groups A, B, and C was milder, and the numbers of apoptosis cells were less when compared with those of group MD. Conclusions: （1） The establishment of ALI-ARDS model with rats is successful; （2） Xuebijing injection has curative effect to ALI-ARDS caused by acute inhaling of YP and its compounds; （3）Apoptosis of lung tissue cells participates in the pathological process of ALI-ARDS in rats caused by acute inhaling of YP and its compounds, and Xuebijing intravenous injection might adjust the apoptosis of lung tissue cells .

    ［Key words］ lung; histiocytes; poisoning; rats,Sprague-Dawley; yellow phosphorus; apoptosis; Xuebijing

    吸入有毒气体是急性肺损伤（ALI）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的重要发病原因之一。黄磷是剧毒物质，主要以蒸气及粉尘形式经呼吸道进入人体,也可经消化道及灼伤的皮肤吸收引起中毒。我科自2003年以来收治多例黄磷吸入急性中毒，以ARDS为突出表现。故行大鼠黄磷吸入中毒实验，对急性黄磷吸入中毒从发病机制到病理及临床治疗进行较系统的研究很有必要，目的在于提高对黄磷吸入中毒的防护和中毒后的治疗水平。目前多数学者认为ALI、ARDS是一种失控的急性炎症反应，细胞凋亡可能在系统性炎症反应综合征（SIRS）、代偿性炎症反应综合征（CARS）起着保持促炎和抗炎2种过程平衡的作用，也有利于适度的组织修复[1]。故有效的调控细胞凋亡，可为治疗ALI、ARDS提供新的治疗角度。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物  健康SD大鼠85只（雌42只，雄43只，分笼喂养），体重220~310 g，由贵阳医学院实验动物中心提供。

    1.1.2  实验设备和器材  产气原料： 优质黄磷、氢氧化钠。染毒柜及气体发生装置、天平、Leica石蜡切片机、Olympus光学显微镜、Biomias99图像分析系统、烘箱、微波炉；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（南京凯基生物工程公司）；血必净注射液、氟美松注射液、5%葡萄糖注射液。

    1.2  方法

    1．2.1  实验动物分组、给药方法及杀鼠时间点  健康SD大鼠85只，  随机分为正常对照组（5只，5%葡萄糖注射液5 ml/kg），模型组（20只，5%葡萄糖注射液5 ml/kg），血必净组（A组，20只，血必净注射液5 ml/kg），氟美松组（B组，20只，氟美松注射液5 mg/kg），血必净加氟美松组（C组，20只,血必净注射液5 ml/kg加氟美松注射液1 mg/kg）。对照组给等量5%GS腹腔注射，模型组于造模后即刻、8 h腹腔内注射等量5%GS， A、B、C组分别于造模后即刻腹腔内注射给药（用5%GS稀释至等量），造模后6 h时间点杀鼠5只，余大鼠造模后8 h腹腔内再次注射给药，分别于12 h、24 h、48 h时间点各杀鼠5只。

    1.2.2  造模  橡皮管（液体石蜡润滑内壁）连接烧瓶与染毒柜，开启气体混匀装置后密封染毒柜及各接口。取黄磷50 g，NaOH50 g，置入烧瓶（内有适量热水）后密封。酒精灯加热，产生气体逐渐由烧瓶经橡皮管通入染毒柜后被混匀，产气15 min后，染毒柜内充满烟雾，快速打开盖，将大鼠分批置入染毒柜（各组置入位置保持恒定），密封柜体，染毒10 min（秒表计时），开盖取出大鼠置笼中呼吸空气5 min（其间密封柜体），反复4次，总染毒时间为40 min，整个造模过程中气体发生及混匀装置均持续工作。

    1.2.3  检测指标  （1）观察实验动物一般表现：大鼠精神状态、体毛、活动、呼吸、进食饮水及排泄情况等；（2）肺组织病理检查：右肺组织置4%中性甲醛溶液固定12~24 h后，取右肺中叶组织，常规石蜡包埋、切片，用于HE染色、光镜观察；（3）肺组织细胞凋亡原位检测（TUNEL法）：通过HE染色在40×40倍物镜下选取无支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞变性坏死的标本，石蜡包埋组织切片后，按照试剂盒说明进行。

    TUNEL法细胞凋亡程度判断标准：阳性细胞呈棕黄色颗粒，位于凋亡细胞核内。出每5个随机40×40倍物镜视野中平均阳性细胞数为凋亡数。

    1.3.  统计学处理

    实验数据以均数±标准差（x±s）表示,采用统计软件SPSS11.5，进行完全随机的单因素方差分析，用ｔ检验比较各均数差异的显著性，P<0.05有统计学意义。

    2  结果

    2.1  实验动物一般表现

    对照组大鼠反应灵敏，进食稳定，呼吸平稳。染毒开始多数动物被毛竖直，出现烦躁，跑动增加、呼吸急促，继之精神明显变差，倦缩少动，呼吸困难，对刺激反应差，抓取时无力反抗逃避。造模过程中无动物死亡。部分大鼠染毒早期即开始进食、饮水，但总体进食、饮水量较正常减少。各治疗组大鼠，开始精神较差，2次给药后症状均有不同程度减轻，精神明显好转，无明显呼吸费力，进食、饮水量增加，治疗后无动物死亡。

    2.2  肺组织病理改变

    正常对照组大鼠胸腔无血性积液，双肺色泽正常、无肿胀。光镜下肺组织结构正常, 无变性、坏死及炎细胞浸润。

    　　模型组ARDS大鼠胸腔内出现较多血性积液,双肺充血并中、重度肿胀,部分肺组织有片状出血或灶状肺不张，气管及肺切面均有较多血性泡沫样液体溢出，肺切面血管内有凝血溢出。光镜下可见ARDS大鼠有明显的肺间质水肿和肺泡水肿,肺内有弥漫性炎性细胞浸润、肺出血、小血管扩张,有微血栓形成（图1）;肺泡结构破坏,多处肺泡上皮细胞出现局灶性肿胀、凝固性坏死,肺间隔增厚,肺泡内可见染色深红均一的蛋白样渗出物。

    A、B、C三组大鼠病理改变较ARDS大鼠减轻,多数动物双肺出现轻、中度肿胀;气管及肺切面有少量血性泡沫样液体溢出,肺出血减轻。光镜下见A组肺泡结构基本恢复正常，肺泡上皮轻度增生、轻度充血及少量炎细胞浸润，无出血、水肿、变性、坏死等病变（图2）；B组肺泡结构基本恢复正常，肺泡上皮中度增生、轻度充血及炎细胞浸润，无出血、水肿、变性、坏死等病变（图3）；C组肺泡结构基本恢复正常，肺泡上皮中度增生、轻度充血及炎细胞浸润，无出血、水肿、变性、坏死等病变（图4）。

    2.3  各组肺组织细胞凋亡数

    各组肺组织细胞凋亡数见表1、图5、表2。表1  对照组与模型组细胞凋亡数比较表2  模型组与各治疗组细胞凋亡数比较 注：t值为A、B、C各组与模型组在各时间点的比较。（1）与模型组比较：在6 h时间点P＞0.05，其他各时间点P＜0.01；（2）A组与B组在12 h、24 h、48 h时间点比较P＜0.05；（2）A组与C组在12 h、24 h、48 h时间点比较P＞0.05；（3）B组与C组在12 h、24 h、48 h时间点比较均P＜0.05

    正常对照组大鼠支气管上皮细胞未见胞核着色；模型组ARDS大鼠支气管黏膜上皮细胞呈明显的棕黄色颗粒改变（图6）；A组48 h支气管上皮细胞胞核呈轻度棕黄色颗粒改变（图7）；B组48 h支气管上皮细胞胞核呈中度棕黄色颗粒改变（图8）；C组48 h支气管上皮细胞胞核呈轻度棕黄色颗粒改变（图9）。

　　 3  讨论

    　  目前检测细胞凋亡的方法有视频时差显微镜技术、显微镜观察、DNA凝胶电泳、ELISA法核小体测定、流式细胞仪定量分析和DNA裂解的原位检测等[2]。本研究应用了TUNEL法DNA裂解的原位检测，检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA 的断裂情况，这是近年来检测细胞凋亡的方法中具有特异性并较可靠的方法。

    本文结果显示，染毒后大鼠出现被毛竖直、烦躁、跑动增加、呼吸急促，继之精神明显变差、倦缩少动、呼吸费力，部分出现闭目、颤抖，随后呼吸困难，呼吸频率较前减慢，对刺激反应差，抓取时无力反抗、逃避，有的出现张口呼吸等呼吸窘迫表现。染毒后大鼠胸腔内出现较多血性积液,双肺充血并中、重度肿胀,部分肺组织有片状出血或灶状肺不张，部分肺叶可见实变，气管及肺切面均有较多血性泡沫样液体溢出，肺切面血管内有凝血溢出；光镜下可见染毒后大鼠有明显的肺间质水肿和肺泡水肿,肺内有弥漫性炎性细胞浸润、肺出血、小血管扩张,有微血栓形成;肺泡结构破坏,多处肺泡上皮细胞出现局灶性肿胀、凝固性坏死,肺间隔增厚,肺泡内可见染色深红均一的蛋白样渗出物（透明膜形成），证明急性黄磷及其化合物吸入致大鼠ALI-ARDS模型成功建立。

    A、B、C 3治疗组大鼠病理改变较ALI-ARDS大鼠均减轻,多数动物表现双肺轻、中度肿胀;气管及肺切面有少量血性泡沫样液体溢出,肺出血减轻。光镜下见肺组织结构基本恢复正常，肺泡上皮轻、中度增生，虽然可见部分肺间质和肺泡水肿、小血管充血及少量炎细胞浸润,但未见微血栓及透明膜形成，无肺组织出血、变性、坏死。血必净、氟美松及二者同时使用对急性黄磷及其化合物吸入所致ALI-ARDS均有效。

    细胞凋亡数在模型组与对照组之间差异具有统计学意义（P﹤0.01），说明肺组织细胞凋亡极有可能参与了大鼠急性黄磷及其化合物吸入致ALI-ARDS的发生、过程。由图4可见，模型组细胞凋亡在24 h达高峰，在48 h时间点低于24 h时间点，各治疗组相应时间点有类似现象，其原因可能与染毒时间长短、黄磷中毒机理等有关，但其具体机制有待于进一步深入研究。

    　　经血必净、氟美松高剂量治疗及血必净加低剂量氟美松治疗，在造模12 h后3个治疗组细胞凋亡数与模型组相比均有明显减少（P＜0.05），证明血必净、氟美松可能具有调节细胞凋亡的作用。而A、B、C 3治疗组之间两两比较，A组、C组分别与B组相比较均P＜0.05，具有统计学意义，而A组与C组比较无统计学意义（P＞0.05），说明3个治疗组对肺组织细胞凋亡都可能有调节作用，A、C组调节细胞凋亡的作用可能强于B组，由此可推断血必净对细胞凋亡的调节影响可能强于氟美松。

    　　细胞调亡在有来自细胞内外的调亡诱导因素时开启，常见的诱导因素有理化因素如射线、高温、寒冷、强酸、强碱、严重外伤等。机体在遭受非感染性打击（如变性坏死组织、缺血缺氧、严重创伤和烧伤等）后，炎症细胞（包括白细胞、单核-巨噬细胞、血小板及内皮细胞）活化，致使多种促炎介质如TNF、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IFN、TXA2、组织因子等失控性释放，可以进一步活化内皮细胞、中性粒细胞及巨噬细胞，NF-κβ释放增加，导致ALI-ARDS及MODS发生。血必净组大鼠肺组织细胞凋亡明显减少的作用机制可能与血必净能强效拮抗炎性介质，调节免疫及炎性介质，拮抗TNFα作用，从而进一步抑制NF-κβ持续活化，促使活化的中性粒细胞凋亡而抑制肺泡上皮、肺血管内皮，支气管上皮的细胞凋亡有关[3]。但具体机制有待于进一步从细胞凋亡调控与血必净药理作用相结合作深入研究。

    Hagimoto等[4]认为,甲强龙可明显抑制博来霉素诱导的小鼠急性肺损伤的肺部炎症反应和肺组织细胞凋亡。任文杰等[5]报道甲强龙能明显降低瓦斯爆炸伤大鼠肺组织细胞凋亡指数及肺组织Fas-FasL蛋白表达。氟美松使黄磷吸入所致的ALI-ARDS肺组织细胞凋亡减少的作用机制可能与其具有稳定机体溶酶体膜、抑制中性粒细胞向炎症部位聚集从而具有抗炎作用以及调节机体免疫系统，促进肺泡Ⅱ型上皮发育、成熟的作用有关。但另有报道氟美松可诱导肺泡上皮细胞凋亡[6]。因此，虽然本研究显示氟美松使黄磷及其化合物吸入所致的ALI-ARDS肺组织细胞凋亡减少，但氟美松与上述细胞凋亡的关系尚不肯定。

    　　ALI-ARDS中细胞凋亡的机制复杂多样，细胞的凋亡与存活取决于多种抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白之间的平衡。血必净与氟美松有可能作用于凋亡调控的某个环节或者多个环节从而影响到细胞凋亡。

    由本文结果来看，血必净、氟美松高剂量、血必净加低剂量氟美松对黄磷及其化合物吸入中毒所致的ALI-ARDS病理改变均有明显的治疗作用，而血必净对肺组织细胞凋亡的调节影响可能强于氟美松。本组样本例数偏少，也未能进一步作凋亡相关蛋白的研究，故其结论有待于扩大样本量，进行更大规模的、更深层次的研究来证实。

【】
  [1]陈灏珠.实用内[M].12版.北京：人民卫生出版社，2005：1794-1795.

[2]郑骏年.细胞凋亡检测方法研究进展[J].国外医学临床生物化学与检验学分册，1999（3）：124-126.

[3]曹书华，王今达.血必净对感染性多脏器功能障碍综合征大鼠组织及内皮组织保护作用的研究[J].危重急救医学，2001（8）：489-491.

[4]Hagimoto N,Kuwano K,Nomoto Y,et al.Apoptosis and expression of Fas/Fas ligan mRNA in bleomycin-induced pulmonary fbrosis in mice[J]. Am J Respr Cell Mol Bio,1997(16):91-101.

[5]任文杰,刘雅,秦祖暄，等. 瓦斯爆炸伤大鼠肺泡上皮细胞凋亡和肺泡表面活性物质的变化[J].中华创伤杂志，2006（5）：389-390.

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